Ⅱ―２
治療検討部門（病理部門）の研究概要と各プロジェクトの成果
治療検討部門（病理部門）研究概要
ハイテクリサーチ申請時の研究課題と主な研究者
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脳血管障害後の組織修復に関するサイトカインや増殖因子の関与、神経系の変性と再生におけるウイルスの関与、グリア細胞白質内移植による修復的治療の研究 |
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所属・職 |
研究者名 |
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病理学第一・教授 講師 講師 |
澤井 高志 黒瀬 顕 宇月 美和 |
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細菌学・教授 |
佐藤 成大 |
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神経精神科･助教授 |
鈴木 満 * |
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解剖学第二・教授 |
佐藤 洋一 * |
（* 研究テーマが病態解明に近いことから、生理部門へ移動）
ハイテクリサーチ選定後の具体的な研究課題と主な研究者および役割 (平成11年～15年)
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所属・職 |
研究者名 |
研究開発プロジェクトにおける研究課題 |
研究開発プロジェクトでの役割 |
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神経内科学・教授 助教授 講師 |
東儀 英夫 阿部 隆志 槍澤 公明 |
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解剖学第二・助教授 |
遠山 稿二郎 |
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病理学第一・教授脳神経外科・医員 |
澤井 高志 菅原 淳 |
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解剖学第二・講師 |
似鳥 徹 |
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病理学第一・教授 |
澤井 高志 |
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病理学第一・講師 |
宇月 美和 |
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細菌学・助教授 |
稲田 捷也 |
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病理学第一・講師 助手 |
黒瀬 顕 斉藤 立華 |
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細菌学・教授 助教授 講師 助手 助手 |
佐藤 成大 平田 陸正 高橋 清実 堤 玲子 小幡 史子 |
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解剖学第二・助教授 |
遠山 稿二郎 |
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社会の高齢化に伴い，脳疾患患者はますます増大することが予測される。これら高齢脳疾患患者のquality of life を高く維持する方策の確立が求められている。当面の具体的目標として，難治性脳疾患の発症・進行を現状より5年程度遅くし，また，中枢神経損傷では，障害範囲を最小限にくい止める具体的方策を戦略的に追究する必要があろう。以上の立場に立ち，本部門では，以下に示す4つのアプローチから，研究を実施した。
１）
加齢を背景とする病的神経変性過程抑制へのアプローチ
高齢者脳で減少の著しいα7ニコチン性アセチルコリン受容体の発現を調節し，増加させることによりニューロン，シナプスを保護し得る可能性を示した。加齢を背景とする脳疾患病態のフリーラジカル仮説をヒト髄液をサンプルに検証し，フリーラジカル抑制の重要性を確認した。また，脳変性疾患病態におけるグリア細胞の重要性を検討し，進行抑制への新たな糸口を示した。さらに神経軸索再生の超微形態を検討し，そのmodulationに関わる分子・細胞の動態を示した。
２）
神経損傷後の続発的損傷増幅抑制へのアプローチ
脳損傷後，続発性に生じる炎症性現象におけるトロンビンの作用を解析し，抗トロンビン剤の二次的脳損傷抑制作用を示した。脊髄損傷後，続発性に生じるアポトーシスが，必ずしも内因性経路ではなく，Fas/Fas ligandを介し生じており，この経路の抑制が重要であることを明らかにした。また， corticotropin releasing
factor family神経ペプチドや内因性大麻物質のアナンダマイドによる炎症増強作用を解析し，神経伝達物質が炎症抑制に向けたターゲット分子となり得ることを示した。
３）
グリオーマの進行抑制に向けたアプローチ
Connective tissue growth factorのグリオーマ組織での発現と脳血管内皮細胞の増殖促進効果をin vivo, in vitro両者で検討し，血管新生抑制によるグリオーマ治療のターゲット分子として有望であることを示した。
４）
中枢神経感染症の病態と早期診断に向けたアプローチ
高齢者は感染症による初期身体徴候が軽く，重症化し初めて気付かれることも少なくない。細菌性毒素による脳症動物モデルを，出血性大腸菌/ベロ毒素により作成し病態を検討した。また，中枢神経細菌感染の，カイコプラズマ試験による迅速診断法を考案した。Cationic antibacterial protein 18kDペプチドの抗菌・抗毒素作用を検討し臨床応用の可能性を示した。ウイルス感染では，AIDS関連性脊髄症の病態を検討した。あわせて経シナプス的に伝搬する向神経性ウイルスが再生シナプス形成性の解析にも有用であることを示した。
以上のように，治療検討部門では多方面からの検討を行い，多くの成果をあげることができた。しかし，一方で，各研究グループのテーマが統一性に欠け，散漫な部分があったことも否めず，今後の検討すべき課題である。
各プロジェクト概要
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アルツハイマー病とフリーラジカル |
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研究代表者 |
阿部 隆志 |
所属 |
神経内科学講座 |
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共同研究者 |
佐藤 千久美 |
所属 |
神経内科学講座 |
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村田 隆彦 |
所属 |
神経内科学講座 |
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東儀 英夫 |
所属 |
神経内科学講座 |
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キーワード（日本語）
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アルツハイマー病 |
一酸化窒素 |
グルタチオン |
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α－トコフェロール |
脳脊髄液 |
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Key Words (English)
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Alzheimer’s disease |
nitric oxide |
glutathione |
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α-tocopherol |
cerbrospinal fluid |
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【背景・目的】
アルツハイマー病（AD）の発症機序はいまだ解明されていないが，一因として活性酸素種（ROS）や活性窒素種（RNS）による神経細胞の酸化的障害が想定されおり，酸化的ストレスとその防御機構のバランスの破綻がADの神経変性過程に関与する可能性が高いと考えられている。本研究では，ADの発症機序や病体にフリーラジカルが関与するか否かを検討する目的で，RNSのうちでもっとも神経毒性の強いperoxynitrite
(ONOO-) の生化学的マーカーである3-nitrotyrosineおよび防御因子であるglutathione，α-tocopherolをヒトの脳脊髄液（髄液）を用いて測定した。
【実験方法・材料】
未治療AD患者（年齢：52－79歳，羅病期間：1.5－10年，Mini-Mental State Examination (MMSE) score：4.0－22.0点）およびage-matchさせた神経疾患を有さない正常対照群を対象とし，腰椎穿刺で得られたの髄液中の3-nitrotyrosine (3-NT)，glutathione (GSH)，α-tocopherol (α-TOH)および関連物質(tyrosine；Try，酸化型glutathione；GSSG，酸化型α-tocopherol (α-tocoperolquinone；α-TQ)濃度をHPLC-ECDを用いて測定した。
【結果】
1－1） 3-NT濃度(nM)が，正常対照群1.6±0.5に比しAD群11.4±5.0で有意に増加していた（p<0.0001）。また，3-NT/Tyr比(×10-4)も正常対照群2.7±0.9に比しAD群18.7±8.7で有意に増加していた(p<0.0001)。Tyr濃度 (µM) は，正常対照群6.0±0.2，AD群6.1±0.7で有意差を認めなかった。
2） 羅病期間と3-NT濃度との間に有意な相関を認めなかったが，3-NT/Tyr比との間に有意な正の相関（rs=0.39，p<0.05）を認めた。
3） 痴呆スケール（MMSEscore）と3-NT濃度および3-NT/Tyr比との間に有意な負の相関を認めた(rs=-0.51，p<0.005，rs=-0.52，p<0.005)。
2－1） GSH濃度 (nM)が，正常対照群85.5±22.3に比しAD群61.4±13.0で有意に減少していた(p<0.01)。GSSG濃度(nM)は，正常対照群20.6±5.4，AD群16.3±4.9で有意差を認めなかった。
2） 羅病期間をGSHおよびGSSG濃度との間に有意な相関は認めなかった。
3） 痴呆スケールとGSHおよびGSSG濃度との間に有意な相関は認めなかった。
3－1） α-TOH濃度(nM)が，正常対照群23.4±8.1に比しAD群12.8±7.3で有意に減少していた(p<0.001)。α-TQ濃度(nM)は，正常対照群7.2±2.8，AD群7.7±7.3で有意差を認めなかった。
2） 羅病期間とα-TOHおよびα-TQ濃度との間に有意な相関は認めなかった。
3） 痴呆スケールとα-TOHおよびα-TQ濃度との間に有意な相関は認めなかった。
【考察と展望】
AD患者の髄液中3-NT濃度および3-NT/Tyr比が正常対照群と比較して各々約7倍もの有意な増加を認めたことにより，ADではNOの産生およびperoxynitriteによるtyrosineのnitrationが亢進している可能性が示唆された。また，3-NT濃度および3-NT/Tyr比と痴呆スケールとの間に有意な負の相関を認めた。すなわち，痴呆の進行に伴い3-NTの産生が増加していくという結果であった。このことからADの病期進行に伴いNOとsuperoxide radical(O2-)から生成されるperoxynitriteの産生が増加していく可能性が考えられる。一方，フリーラジカルスカベンジャーであるglutathione，α-tocopherol濃度は正常対照群に比べAD群では各々有意に減少していた。このことにより，AD患者ではもともと脳内のglutathione，α-tocopherol濃度が正常者に比べ少なく，ROSおよびRNSによる酸化的ストレスに対する抗酸化機構が脆弱である可能性が考えられる。以上より，ADでは酸化的ストレスとくにNO産生とglutathione，α-tocopherolによる防御機構のバランスの破綻が生じており，それがADの発症メカニズムや病態に深く関与している可能性が示唆された。
今後，ADの早期段階（病理学的変化の前）で生じていると推定されているRNAの酸化について，髄液中で検討する予定である。また，他の神経変性疾患（パーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症）についても，フリーラジカルの関与について検討する予定である。
≪研究業績≫
1) Tohgi
H, Abe T, Yamazaki K, Murata T, Ishizaki E, Isobe C: Increase in oxidized NO
products and reduction in oxidized glutathione in cerebrospinal fluid from
patients with sporadic form of amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett 260:204-206, 1999
2) Tohgi
H, Abe T, Yamazaki K, Murata T, Ishizaki E, Isobe C: Alteration of
3-nitrotyrosine concentration in the cerebrospinal fluid during aging and
patients with Alzheimer's disease. Neurosci
Lett 269:52-54, 1999
3) Tohgi
H, Abe T, Yamazaki K, Murata T, Ishizaki E, Isobe C: Remarkable increase in
cerebrospinal fluid 3-nitrotyrosine in patients with sporadic amyotrophic
lateral sclerosis. Ann Neurol 46(2):129-131, 1999
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ニコチン性アセチルコリン受容体α7の発現機構と神経細胞形質との関連 |
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研究代表者 |
槍沢 公明 |
所属 |
神経内科学講座 |
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共同研究者 |
長根 百合子 |
所属 |
神経内科学講座 |
キーワード（日本語）
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ニコチン性アセチルコリン受容体α7 |
神経分化 |
PC12細胞 |
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ERK |
Cdk5 |
Akt |
Key
Words (English)
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α7nAChR |
differentiation |
PC12 cells |
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extracellular-signal-regulated kinase |
cyclin-dependent kinase 5 |
Akt |
【背景・目的】
ニコチン性アセチルコリン受容体α7（α7nAChR）はα7サブユニット単独の\5量体からなるCa2+チャンネル型受容体である。 α7nAChRの役割に関し, 興奮性シナプス伝達調節作用，胎生期の神経回路の形成・維持作用, 様々な神経細胞障害（栄養因子欠乏，βアミロイド，グルタメートなど）に対する抑制作用の報告がある。しかし，このような多様な作用が, リガンド依存性に生じるα7nAChRからの速いCa2+ influxのみで生じ得るのか否かは不明である3, 4, 5。新皮質のα7nAChRは胎生期に一過性高発現を示す一方, 成人では加齢に伴う減少が著しい1。またストレスに応答し速やかにup-regulationされる2。我々は，α7nAChRを過剰発現するPC12細胞を作成し, 受容体発現とシグナル伝達系との関連を検討した3, 4, 5。
【実験方法・材料】3, 4
ラット脳cDNAライブラリーからα7サブユニット遺伝子をRT-PCR法で増幅, pCMV-Tag4ベクターにライゲーションし, 得られたプラスミドをPC12細胞に導入した。α7nAChRの過剰発現によるPC12細胞の形質変化, シグナル伝達系, 細胞周期の変化を検討した。Protein kinase C (PKC)δについて, はそのdominant-negative （ATP-binding mutant, PKCδK376R) 導入細胞（PKCδK376RpEF1）にα7nAChRを過剰発現し検討した。細胞周期分布についてはflow cytometryによるDNA量ヒストグラムを検討した。
またα7nAChR過剰発現細胞の一過性低酸素負荷 (O2: 2%, 12h)後の動態を検討した。
【結果】
α7nAChR過剰発現PC12細胞の形質変化3, 4:
α7nAChR過剰発現PC12細胞はリガンド非存在下でコントロール（PC12細胞やベクターのみ導入したPC12細胞）に比し, 高い遊走性, 接着性, 神経突起伸長性を示し, かつ増殖速度を減じた。また, α7nAChR過剰発現細胞 (リガンド非存在下)ではG2期の細胞比率が増加した。
α7サブユニット遺伝子導入後のPC12細胞では持続的ERKリン酸化が生じる3, 4:
α7nAChR発現増加に伴い生じる神経突起伸長亢進が, 分化誘導性のシグナルを介するか否かを検討した。 á7サブユニット遺伝子導入後のPC12細胞(リガンド非存在下)では, α7蛋白発現とほぼ同時(遺伝子導入24h後)に著しいextracellular-signal-regulated kinase (ERK)のリン酸化が生じ, 持続した。 flow cytometryによる検討では, 神経分化関連性の接着分子であるN-cadherinの発現も亢進した。 α7nAChR発現増加は, リガンドの有無に関わらず, 持続的ERKリン酸化と神経突起伸長性亢進を伴う。
α7nAChR過剰発現PC12細胞では低酸素性細胞障害が抑制される3:
一過性低酸素負荷後, 早期から生じる細胞膜障害はα7nAChRとリガンドの相互作用により抑制された。 一方, 遅発性に生じるDNA断片化は,α7nAChR過剰発現細胞では, リガンド非投与でも明らかに抑制された。
α7nAChR過剰発現細胞ではコントロールに比しAkt蛋白の発現量が低酸素負荷前より高く, 低酸素負荷後のAktリン酸化が著しかった。 細胞周期分布を検討したところ, コントロールで低酸素負荷後12-24h に生じるG1-arrestがα7nAChR過剰発現細胞(リガンド非存在下)では回避された。
α7サブユニット遺伝子導入後のERKリン酸化の持続にはPKCδが必要である:
dominant-negative PKCδを発現するPC12細胞(PKCδK376R細胞)にα7cDNAを導入し検討した。 PKCδK376R細胞ではα7導入後, ERKリン酸化は持続せず, 突起伸長, α7nAChRの細胞膜表面への発現もみられなかった。機能的α7nAChR過剰発現とERKリン酸化の持続はERKとPKCδのcross-talksを必要とする。
α7nAChR過剰発現PC12細胞ではタウ蛋白リン酸化が亢進する:
α7nAChR導入PC12細胞(リガンド非投与)に生じるERKの持続的リン酸化によりcyclin-dependent kinase(Cdk)5-p35経路とタウ蛋白リン酸化が亢進するか否かを検討した。
この経路は, 高齢者で増加する痴呆性疾患（tauopathy，Alzheimer型痴呆）との関連から注目される。Cdk5-p35/p25経路, タウ蛋白リン酸化はα7nAChR導入後, 亢進し, これはERK経路の阻害により抑制された。
【考察】3, 4
α7nAChR発現は胎生期の発達脳においてよく検討されており, シナプス形成過程のニューロンで一過性高発現を示す事が知られている。 機能的α7nAChRの発現調節は細胞骨格構造の変化や細胞周期調節機構と密接に関連し行われているらしい。 ERKは神経細胞の分化誘導, 神経突起伸長促進作用を有し, 中枢神経系の発達に重要な役割を担っていることが知られている。
従来の知見と我々の結果を考えあわせると, α7nAChRとERKシグナルは密接にリンクしながらシナプス形成促進性に作用している可能性がある。
同時に, 加齢に伴うα7nAChR減少は神経回路形成性, 可塑性を低下させる可能性も考えられる。
α7nAChR発現と, これとリンクするERKシグナルはシナプス形成促進性に作用し, かつニューロンの急性ストレス耐性を高める可能性があるが, 同時に, このシステムの過度の作用は, Cdk5-p35/p25経路やタウ蛋白リン酸化を亢進させてしまう可能性もある。
α7nAChRの多様な作用には, Ca2+チャンネルとしての作用によるもののみならず, 自身の発現調節系に関連するものがあると考えられる。 しかし, 今回の結果はin vitroの成果であり, PC12細胞と成熟ニューロンとの相違も考慮せざるを得ず, 検討の余地を残した。
≪研究業績≫
1) Utsugisawa K, Nagane Y, Tohgi H, Yoshimura M, Ohba H, Genda Y: Changes with aging and ischemia in nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha7 mRNA expression in postmortem human frontal cortex and putamen. Neurosci Lett 270:145-8, 1999
2) Utsugisawa K, Nagane Y, Obara D, Tohgi H: Increased expression of alpha7 nAChR after transient hypoxia in PC12 cells. Neuroreport 11:2209-12, 2000
3) Utsugisawa K, Nagane Y, Obara D, Tohgi H: Over-expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor prevents G1-arrest and DNA fragmentation in PC12 cells after hypoxia. J Neurochem 81:497-505, 2002
4) Utsugisawa K, Nagane Y, Obara D, Tohgi H: Over-expression ofα7 nicotinic acetylcholine receptor induces sustained ERK phosphorylation and N-cadherin expression in PC12 cells. Mol Brain Res 106: 88-93, 2002
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CNSおよびPNSにおける神経軸索再生時のグリア細胞の役割 |
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研究代表者 |
遠山 稿二郎 |
所属 |
解剖学第二講座 |
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共同研究者 |
Lieberman AR |
所属 |
University College London, Dept Anatomy |
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DiFiglia
M |
所属 |
MGH,
Dept Neurol, Lab for Cellular Neurol |
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Anderson
PN |
所属 |
University College London, Dept Anatomy |
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Campbel
G |
所属 |
University College London, Dept Anatomy |
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糸原 重美 |
所属 |
理研 脳科学総合研究センター 行動遺伝 |
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端川 勉 |
所属 |
理研 脳科学総合研究センター 神経構築 |
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キーワード（日本語）
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ミクログリア |
アストロサイト |
S100B |
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ハンチントン病 |
軸索再生 |
ニューログリカン2 |
Key
Words (English)
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microglia |
astrocyte |
S100B |
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Huntington disease |
axonal regeneration |
NG2 |
【背景・目的】
神経系の研究は，これまで，ニューロンそのものに焦点が当てられる傾向にあった。しかし，近年の分子生物学的手法の普及により，グリア細胞が様々な物質を作り出し，神経細胞に強い影響を与える事実が明らかになってきている。
私達は，生体（主に実験動物）に様々な非生理的環境（傷害・感染）をグリア細胞への負荷としてとらえ多様な角度から，グリア細胞の動態を主に形態学的手法によって研究している。また，実際の病理標本の解析を通じて，病態解明を目指している。
本研究では，ミクログリア，アストロサイト，シュワン細胞に焦点を絞り，また神経損傷と軸索再生に関与する物質として，テネイシン，NG2，S100Bについて解析した。
【実験方法・材料】
1) ミクログリアの形態を解析するため，ヒトサイモシンに対する抗体を作成し，ハンチントン病の脳において，免疫組織学的に検索した。本抗体はゼブラフィッシュからヒトのミクログリアを特異的に標識することができる。
2) ラットの脊髄後根を切断し，DRGニューロンの再生軸索に関わる後根脊髄境界部（DREZ）でのアストロサイトの動態を，免疫組織化学・電子顕微鏡解析を含む形態学的研究を実施した。
3) シュワン細胞のS100Bの役割を検討するため，S100Bノックアウトマウスを使用し，末梢神経切断後の軸索再生について電子顕微鏡による解析をおこなった。
4) 末梢神経を切断し，NG2の免疫組織化学を実施した。
【結果】
1）
本疾患の主病変部位とされる線条体および，特に初期ではほとんど病変が確認できない大脳皮質について免疫組織学的検索をおこなった。その結果，病変の早期から，大脳皮質，線条体ともにミクログリアの形態が大きく変化していた。この変化は，大脳皮質で特に顕著で，ハンチンチンの局在との関係を検索したが，その発現いかんにかかわらず，ミクログリアが変形し，神経細胞に接する形態が観察された1)。
2）
(i) 解きほぐし標本 (teasing)の電子顕微鏡で，後根切断後に切断部から伸び出したDRGの再生軸索の走行を観察した。再生軸索は，それまで軸索が存在したと考えられるシュワン細胞・軸索単位の表面を取り巻いている基底膜の筒内を進むが，DREZ近傍で基底膜筒から外に出て，他の基底膜筒に侵入しUターンしていた。この時，軸索はUターン部でもシュワン細胞に囲まれていた。(ii) 後根切断後，DREZからアストロサイトの突起が末梢側に伸びだし，その先端が膨隆していた。(iii) この末梢側に突起を伸長したアストロサイトを含み，脊髄境界を形成するアストロサイトにはテネイシンRは見られないが，脊髄内部に分布するアストロサイトはテネイシンR陽性を示した。(iv) 幼弱なオリゴデンドログリアのマーカーであるNG2を持った円形細胞が，切断後根のDREZに集積する2)。
3）
S100Bノックアウト動物でも，末梢神経切断後，正常マウスと同様な軸索再生能を有していた。
4）
末梢神経切断後，切断端より末梢側においてNG2の強い発現が見られた。
【考察と展望】
1）
ハンチントン病におけるミクログリアの形態変化を明らかにした初めての研究である。ハンチンチンを発現するトランスジェニックマウスでも，ほぼ同様な結果が得られており，本病態の発生機序にかかわる重要な現象と考えている。この現象は，ミクログリアの役割を，中枢神経内での単なる貪食細胞とする考え方では理解し得ないものであり，ミクログリアの機能の多様性を示すものと考えられる。
2）
後根軸索の脊髄内進入を阻害する因子の一つとして，テネイシンRおよびNG2陽性細胞の関与が考えられた。中枢神経内のアストロサイトはテネイシンR陽性であるが，中枢神経経のグリア境界膜を形成するアストロサイトには欠如することが，初めて示された。これは，脊髄内のアストロサイトの多様性を示したもので，異なる機能を持っている可能性を示唆するものである。言いかえれば，従来の考え方では同一のグループにまとめられていたグリア細胞が異なる機能を果たす可能性を明かにしたものである。また，NG2陽性細胞は，現時点では，同定不可能の細胞であり，従来のグリア細胞のどの範疇にも入れることができない細胞である。今後の研究が期待される。
3）
軸索再生に必須と考えられて来たS100Bのノックアウト動物を使用し，S100Bが無くても末梢神経は再生できることを示した。したがってこれらの分子は必ずしも一義的な機能では無い。
4）
NG2陽性細胞はDRGからの再生軸索の進入を阻止すると考えられた。一方，神経軸索が再生する末梢神経の切断実験においても切断端末梢側にNG2が強く発現する事実を見出した。このことより，NG2のような軸索伸長を抑制すると考えられる分子が，軸索再生時には不必要なものでは無く，一定の役割を持っていることが考えられる。私達は，一般に軸索伸長抑制因子が末梢神経系で果す役割を解析することで，軸索再生のメカニズムに迫ることができると考えている。
≪研究業績≫
1) Sapp E, Kegel KB, Aronin N, Hashikawa T, Uchiyama Y, Tohyama K, Bhide PG, Vonsattel JP. and DiFiglia M.: Early and progressive accumulation of Reactive microglia in the Huntington’s disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60: 161-172, 2001
2) Zang Y, Tohyama K, Winterbottom J.K, Haque N.S.K, SchachneR M, Lieberman A.R. and Anderson P.N.: Correlation between putative inhibitory molecules at the dorsal root entry zone and failure of dorsal root axonal regeneration. Molecular and Cellular Neuroscience 17: 444-458, 2001
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損傷脳における炎症性細胞遊走，集簇のトロンビンの関与の解明 |
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研究代表者 |
菅原 淳 |
所属 |
病理学第一講座 |
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共同研究者 |
久保 慶高 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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鈴木 倫保 |
所属 |
山口大学 脳神経外科学講座 |
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澤井 高志 |
所属 |
病理学第一講座 |
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小川 彰 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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キーワード（日本語）
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神経外傷 |
トロンビン |
炎症細胞 |
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サイトカイン |
接着分子 |
アポトーシス |
Key Words (English)
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trauma |
thrombin |
inflammatory cells |
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cytokine |
adhesion molecule |
apoptosis |
【背景・目的】
脳損傷に引き続いて起こる出血では凝固系が活性化され，トロンビンが産生される。トロンビンは血液凝固反応のみでなく，炎症，血管，神経の分野など作用が多岐にわたっている。これまで我々は，このトロンビンの中枢神経への関与に着目し，ラット基底核に高濃度トロンビンを持続注入するモデルを用いて，炎症性細胞の集簇，グリア反応，間葉系細胞の増殖，血管新生がトロンビンによって引き起こされ，トロンビンが組織修復に関わっている反面，濃度によってはむしろ有害的に作用することを示唆してきた(参-1)。また，抗トロンビン剤を投与することにより，脳損傷部位近傍における炎症性細胞浸潤の抑制し，炎症反応に引き続いて起こる二次的脳損傷の抑制を報告してきた(参-2)。本研究では，損傷脳においてトロンビンが関与する「炎症」の病態の解明と新しい治療を目的に，1)トロンビンの損傷脳における炎症性細胞の集簇に対する影響，2)接着分子の発現に対する影響を，抗トロンビン剤をラット脳損傷モデルに投与し，組織学的に検討した。
【実験方法・材料】
200-250gの雄SDラット43匹にペントバルビタ-ル腹腔内麻酔後，無菌操作でbregmaから外側3.5mm，後方0.2mmに約3mmの小開頭を設けた。皮質ならびに皮質下切創を加え，止血終了後にゼラチンを留置し，生理食塩水(以後，生食群)，濃度0.5μg/mlのアルガトロバン生理食塩水希釈液(以後，アルガトロバン群)を20μl滴下した。(1) 脳損傷作成1，3，5，7日後に灌流固定を行い，パラフィン切片を作製してHEならびに免疫染色を施行した。HE染色では多核白血球，免疫組織化学的には抗Mo/MF抗体を用いて単球系細胞を同定し，抗GFAP抗体によりGFAP陽性アストロサイト，抗vimentin抗体によりvimentin陽性アストロサイトを同定した1)。(2) 脳損傷作成4，24，48，72，120時間後に灌流固定を行い，凍結切片を作製してHEならびに免疫染色を施行した。HE染色では多核白血球，免疫組織化学的には抗Mo/MF抗体を用いて単球系細胞，抗ICAM-1抗体によりICAM-1陽性血管，抗CD-11b抗体によりICAM-1のリガンドであるMac-1を同定した。なお，抗CD34抗体により血管総数についても検討した2)。染色後の評価は創部に留置したゼラチンと創縁周囲に関心領域を20箇所設定し，各抗体の陽性細胞の数の時間経過を生食群とアルガトロバン群で比較検討した。
【結果】
(1) 抗トロンビン剤を損傷脳に局所投与して，炎症性細胞の集簇，反応性アストロサイトの増殖を検討したところ，創縁における多核白血球は生食群，アルガトロバン群ともに，術後1日目で少数認めるのみで，それ以降は認めなかったが，術後1日目で治療群は有意に細胞の集簇を抑制した。一方，単球系貪食細胞は，両群ともに術後1日目から3日目にかけて有意な増加を認め，術後1，5，7日目でアルガトロバン群は有意に細胞の集簇を抑制した。ゼラチン内における多核白血球は，両群ともに術後3日目で最高値をとり，5日目以降には認めかったが，術後1，3日目でアルガトロバン群は生食群に比べ，有意に細胞の集簇を抑制した。単球系貪食細胞は，術後3日から5日，5日から7日にかけて有意に増加した。術後5日目，7日目でアルガトロバン群は有意に細胞の集簇を抑制した。vimentin陽性アストロサイトは両群ともに3日目から5日目にかけて有意な増加を認めたが，5日目以降は減少した。術後3，5，7日目でアルガトロバン群は有意に細胞の増殖を抑制した。GFAP陽性アストロサイトは両群ともに術後1日目から3日目にかけて有意に増加し，それ以降も漸増を認めたが両群間で有意差は認めなかった1)。(2) 抗トロンビン剤を損傷脳に局所投与して，炎症性細胞の集簇，接着分子の発現を検討したところ，創縁における多核白血球は，両群ともに損傷後4時間ではほとんど認められず，24時間後で最高値をとり，それ以降は減少していく傾向を認めた。損傷後24，48，72時間でアルガトロバン群は有意に細胞の集簇を抑制した。創縁における単球系細胞は，両群ともに24時間後から72時間後にかけて有意な増加を認めた。損傷後24，48，72，120時間でアルガトロバン群は有意に細胞の集簇を抑制した。創縁におけるMac-1陽性細胞は，4時間後では細胞の集簇はほとんど認められず，24，72時間後で頂点とる二峰性の傾向が認め，72時間以降は次第に減少していく傾向を認めた。損傷後24，48，72，120時間でアルガトロバン群は有意に細胞の集簇を抑制した。創縁におけるICAM-1 陽性血管は，両群ともに4時間後で認め，それ以降は漸増し48時間後で最高値をとり，減少していく傾向を認めたが，120時間後でもICAM-1の発現の増加は認めた。損傷後24，48，72時間でアルガトロバン群は有意に陽性血管の発現を抑制した。創縁におけるCD 34陽性血管は，両群ともに4時間後から72時間では，陽性血管数の増加傾向は認めなかった。120時間後にて陽性血管数の増加が認めたが，両群に有意な差は認めなかった2)。
【考察と展望】
(1)にて，抗トロンビン剤が炎症性細胞の集簇を抑制したことにより，トロンビンが損傷脳において炎症性細胞の集簇を誘導することが考えられた。また，創縁におけるvimentin陽性アストロサイトの増殖を抑制し，GFAP陽性アストロサイトには影響を与えなかった。GFAP陽性アストロサイトが損傷側大脳に広く出現し，その一部に神経栄養因子の分泌作用を有するとされている。他方，vimentin陽性アストロサイトはラット正常脳には認められず，脳損傷部位近傍に一過性に出現し，高い増殖能を有する幼弱なアストロサイトで，過度の瘢痕化を誘導し，神経再生の障害となりうることが考えられる。今回，抗トロンビン剤はvimentin陽性アストロサイトを抑制する一方，neuroprotectiveな要素を含むGFAP陽性アストロサイトには影響を与えなかったことより，神経再生の障害を抑制する可能性が示唆された。(2)では，抗トロンビン剤を局所的に投与することにより，創縁周囲のMac-1陽性細胞の浸潤とICAM-1 陽性血管数を有意に抑制した。アルガトロバンは，トロンビン作用を選択的に阻害する薬剤であるので，今回の投与によって観察されたMac-1陽性細胞，ICAM-1陽性血管に対する抑制効果は，トロンビン作用の抑制に起因すると考えられた。また，血管内皮については，今回の実験ではアルガトロバン群と治療群での創縁周囲の総血管数には有意の差はなかった。そして，アルガトロバン群でICAM-1陽性血管数が有意に減少していことから，今回の実験の時間帯では，トロンビンによる血管新生の作用はないものの，トロンビンによる血管内皮上にICAM-1を誘導する作用があり，抗トロンビン剤がこれを抑制したものと考えらた。以上より(1)トロンビンが血管における接着分子を発現させ，炎症性細胞の浸潤を引き起こし，急性炎症に引き続いて起こる二次的脳損傷を惹起すること，(2)トロンビンが脳損傷後に形成される瘢痕の主体であるvimentin陽性アストロサイトの増殖を促すことが明らかとなった。抗トロンビン剤により，これらの作用を抑制することで，脳損傷後の二次的障害を抑制する可能性が示唆された。
≪参考論文≫
(1)
Nishino et al.: J Neurotrauma 10,
167-179, 1993
(2)
Motohashi et al.: J Neurotrauma
14, 747-754, 1997
≪研究業績≫
1)
Kubo Y, Suzuki M, Kudo A, Yoshida K,
Suzuki T, Ogasawara K, Ogawa A, Kurose A and Sawai T: Thrombin Inhibitor
Ameliorates Secondary Damage in Rat
Brain Injury: Suppression of Inflammatory Cells and Vimentin –positive
Astrocytes，J Neurotrauma 17,
163-172, 2000
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神経組織の虚血性変化と，薬物による抑制効果 |
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研究代表者 |
似鳥 徹 |
所属 |
解剖学第二講座 |
キーワード（日本語）
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神経細胞死 |
アポトーシス |
ネクローシス |
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一過性脳虚血 |
永久脳虚血 |
プロスタサイクリン |
Key
Words (English)
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neuronal death |
apoptosis |
necrosis |
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transient ischemia |
permanent ischemia |
prostacyclin |
【背景・目的】
虚血に伴う神経細胞の死は一般的にnecrosisによるものと考えられてきた（参1）。本研究者は短時間脳虚血モデルを用い，海馬CA1錐体細胞の遅延性細胞死過程を精査し，このモデルにおける神経細胞の死はapoptosisが主体であることを報告した（参2）。この結果を元に，神経細胞保護作用があると考えられるprostacyclin analogue （TTC-909）の虚血直後投与実験を行い，CA1錐体細胞のapoptosisからの回避を目的として形態学的な解析を行った。さらに，中大脳動脈永久閉塞モデルに見られる神経細胞死の解析を行い，異なった虚血障害に伴う神経細胞死の機構の差異を検討した。
【実験方法・材料】
スナネズミの両側総頚動脈を5分間閉塞後血流を再開し，一過性脳虚血侵襲を負荷した。虚血再還流直後の動物にPGI2誘導体である TTC-909（100
ng/kg or 500 ng/kg），または3H-TTC-909を静脈内投与した。虚血･再還流後1日～7日の経過後の脳切片において，リソゾームシステインプロテアーゼの免疫反応性変化の検索，TUNEL法によるapoptosisの検証，並びにAutoradiographyによる薬物位置の同定を行った。また，本態性高血圧ラットの片側中大脳動脈枝を永久閉塞し，虚血後の大脳皮質虚血梗塞巣及び梗塞周囲領域penumbraの変性経過を形態学的に検索した。
【結果】
対照群の海馬CA1錐体細胞は，虚血･再還流後3日までに自己融解小体の形成を伴う細胞萎縮を示し，虚血3日後からTUNEL陽性の核DNAの断片化を伴うapoptosisの形態像を示すようになり，虚血7日後までにはミクログリアにより貪食処理される。ところが，TTC-909投与群ではリソゾームシステインプロテアーゼの増強によって検証される自己融解小体の形成が抑制され，細胞形はほぼ完全な形態で観察された。また，虚血3日後の同部位のTUNEL反応を見ると，100
ng/kg のTTC-909投与群ではTUNEL陽性反応を示す錐体細胞の数が減少傾向を示すようになり，500 ng/kg投与群では明かにTUNEL反応陰性の健常な細胞が数多く観察された。さらに，500 ng/kg投与群で，虚血後5日～7日経過した複数の動物の海馬領域において，何ら損傷変化を示さない健常なCA1錐体細胞層が観察された。そこで，TUNEL法で染色した切片に分布するCA1錐体細胞のdamage
scoreを計測し，統計学的に解析した結果，対照群の損傷度に比べTTC-909投与群の損傷度は有意に減少していることが検証された。
Autoradiographyにより，3H-TTC-909の作業部位の同定を試みた結果，3H-TTC-909は脳切片中の神経細胞，とりわけ海馬CA1錐体細胞上に明白な局在を示すことが光顕的･電顕的検索によって明らかになった。
中大脳動脈閉塞実験動物の虚血領域には，虚血後2時間まで梗塞巣が形成され，神経細胞はnecrosisによる細胞死の様相を呈する。同時期のpenumbraでは一部細胞質の変容を示す星状膠細胞の出現と共に，2種の微細形態変化を示す神経細胞が観察され，虚血後6時間では膨化して明らかにnecrosisに陥った神経細胞と，萎縮してapoptosisに陥った神経細胞が混在して観察された。
【考察と展望】
スナネズミの短時間虚血モデルを用いてprostacyclin analogue （TTC-909）の虚血直後投与実験を行い，この薬剤が虚血負荷を被った海馬CA1錐体細胞のapoptosisを妨げる神経細胞保護効果を持つ可能性が示唆された。
PGI2は血小板凝集阻害作用や血管拡張作用を有し，虚血性脳血管障害の治療薬として注目されてきた。TTC-909はラット中大脳動脈閉塞モデルにおいて梗塞部周辺領域の低下した脳血流の改善や，低下した脳グルコース代謝を改善する作用が認められている。これに加えて本研究の結果より，3H-TTC-909が脳血液関門を透過して，神経細胞に直接作用することが明らかとなった。TTC-909の活性本体であるTEI-7165は，培養神経細胞においてCa2+の細胞内流入抑制効果が検証されており（参3），TTC-909は虚血性神経細胞死の引き金として広く受け入れられている“グルタミン酸‐Ca2+毒性仮説” （参4）に提唱されるCa2+の流入抑制により，神経保護効果に関与するものと思われた。しかし， TTC-909投与による海馬CA1錐体細胞の細胞死の回避は，虚血後3日の群では顕著であったが，虚血後7日の群では数例を除いて多くの神経細胞は変性後処理されていた。従って，TTC-909の神経細胞保護効果は，細胞質の縮小化や核DNAの断片化を伴うapoptosisへの移行を遅延させる延命作用と考えるのが妥当であると思われた。
以上の研究結果に関して論文を作成・投稿し，現在査読中である。
また，中大脳動脈永久閉塞実験により，従来虚血障害には最も強いとされていた星状膠細胞が，虚血後2時間のpenumbraでは既に変容し，神経細胞に先立って死に向かう可能性が示唆された。星状膠細胞の変性は，神経細胞のapoptosisとnecrosisの起動に深く関与するものと思われた。
≪参考論文≫
(1) Uchiyama Y: Arch Histol Cytol 58:127-137, 1995
(2)
Nitatori T, et al.: J Neurosci
15:1001-1011, 1995
(3) Hara I, et al.: Europ
Neuropsychopharmacol 6 (suppl.):195, 1996
(4) Choi DW: Neuron 1:623-634, 1988
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脊髄損傷モデルでのFas-Fas ligand系を介したアポトーシスについて |
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研究代表者 |
澤井 高志 |
所属 |
病理学第一講座 |
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共同研究者 |
吉野 修 |
所属 |
富山医科薬科大学 整形外科 |
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宇月 美和 |
所属 |
病理学第一講座 |
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松野 博明 |
所属 |
富山医科薬科大学 整形外科 |
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遊道 和雄 |
所属 |
富山医科薬科大学 整形外科 |
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阿部 由美子 |
所属 |
富山医科薬科大学 整形外科 |
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木村 友厚 |
所属 |
富山医科薬科大学 整形外科 |
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キーワード（日本語）
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脊髄損傷モデル |
アポトーシス |
Fas |
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Fasリガンド |
MRLマウス |
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Key Words (English)
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traumatic spinal cord injury |
apoptosis |
Fas |
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Fas ligand |
MRL mice |
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【背景・目的】
外傷などによる脊髄損傷では損傷による二次的な影響によって，実際に損傷を加えた範囲よりも広範囲に損傷がおこる。神経組織の発生過程において，神経細胞のアポトーシスがおこることは古くから知られていたが，虚血や感染，外傷などによっても，脊髄でのアポトーシスが起こるということが最近報告されるようになった(参-1)。これらの報告ではアポトーシスが脊髄に二次的なダメージを引き起こす原因の一つである可能性を示唆している。アポトーシスは様々な原因によって誘導されるが，Fas/Fas ligand を介した系(参-2)，TNF/TNF receptorを介した系，TRAIL/TRAIL receptor を介した系の他に放射線照射や薬剤性のものなどがよく知られている。Matsuyamaらは，虚血後の脳や脊髄ではFas抗原を介したアポトーシスが起こっていることを報告しているが，本研究では，Fas欠損動物であるMRLマウスを用いて，脊髄損傷後の組織像の変化を検討し，脊髄損傷におけるFas抗原の関与について検討した。
【実験方法・材料】
Fas欠損のミュータントマウスであるMRL/MP-lpr/lpr(MRL/lpr)マウス56匹とwilld type のMRL/Mp-+/+ (MRL/+)マウス56匹を用いた。マウスはいずれも10週齢の雄を用いた。マウスをペントバルビタール麻酔下に，顕微鏡下に第9胸椎のレベルで椎弓切除を行い，2cmの高さからから2.5グラムのチップを髄膜上に落下させた。チップの落下を行わない，椎弓切除のみの群をシャム対照群とした。これらのマウスについて，損傷後の8週目までの臨床的な症状の評価をBasso-Beattie-Bresnahan (BBB) scale にて経時的に行った(参-3)。外傷による脊髄の病理組織像の変化については脊髄組織を縦切し，矢状断の標本を作成し，観察をおこなった。アポトーシスについてはTUNEL法と電子顕微鏡的な観察を用い，Fas, Fas ligand については免疫組織化学にて陽性細胞を検討した(参-4)。また，陽性細胞の種類の同定には免疫組織化学で各種細胞マーカーを染色しておこなった。一部細胞の同定には二重染色をおこなった。
【結果】
臨床症状の評価については，機能不全はいずれのモデルでも外傷を加えてから1日後から徐々に回復し，14日後には後足を用いて移動できるようになった。14日目まではマウスによる差は見られなかったが，21日目ではコントロール群とミュータントマウスとで有意差がみられはじめ，56日後にはコントロール群のMRL/+マウスよりもMRL/lprマウスの方での回復の程度が良くなっていた。組織学的には損傷を加えた後に，脊髄の変性が観察され，病変部はその後アストログリアの瘢痕組織に置換された。損傷の範囲は実際の損傷範囲よりも拡大していたが，拡大範囲についてもMRL/lprマウスでコントロール群のMRL/+マウスよりも有意に小範囲であった。TUNEL法で確認したアポトーシス細胞については損傷後1日から観察され，2日目をピークとして増加した。アポトーシスとなる細胞はオリゴデンドロサイトや神経細胞であってが，陽性細胞数はMRL/lprマウスでコントロール群のMRL/+マウスよりも有意に小さかった。また，FasおよびFas
ligand 陽性細胞についても検討をおこなったが，コントロール群のMRL/+マウスでは陽性細胞の大部分は灰白質に分布していたが，実際に損傷が加えられた範囲より広範囲に陽性細胞が認められた。MRL/lprマウスやシャム対照群ではFasおよびFas
ligand陽性細胞が認められなかった。
【考察と展望】
今回の実験では，脊髄損傷後の臨床症状の回復，および二次的な損傷部位の拡大について，Fas欠損型のミュータントマウスと野生型のマウスを用いての比較，検討をおこなったが，いずれの場合にもFas欠損型のミュータントマウスでは二次的な損傷の範囲は少なくなっていた。また，組織学的にもアポトーシスとなった細胞の分布範囲がFas欠損型のミュータントマウスでは野生型よりも小さくなっていた。野生型のマウスでは実際に脊髄損傷を加えた範囲よりも広い範囲にFas抗原陽性細胞が分布していた。これらのことより，脊髄損傷後の二次的な損傷部位の拡大についてFas/Fas ligand 系を介したアポトーシスが関与していることが示唆された。外傷などによる脊髄損傷の二次的な損傷範囲の拡大をおさえる治療法はまだ十分には確立していないが，治療法の可能性として，抗体投与療法やgene transfer などでFas/Fas ligand 系を介したアポトーシスの抑制を行う治療法が考えられる。
今後の課題としてはFas/Fas ligand 系以外の系を介したアポトーシスの制御についても検討する必要がある1)。
≪参考論文≫
(1) Yonehara S, Ishii A and Yonehara M: J
Exp Med 169 1747-1756, 1989
(2)
Katoh K, Ikata T, Katoh S et al.: Neurosci
Lett 216. 9-12, 1996
(3)
Basso DM, Beattie MS and Bresnahan JC:
Neurotrauma 12, 1-21,
1995
(4) Sasano H, Uzuki M, Sawai T, et al.: Journal of
Bone and Mineral Research 12 : 1416-1423, 1997.
≪研究業績≫
1)
Matsuno H, Yudoh K, Morita I,
Sawai T, Uzuki M, Hasunuma T, Nishioka K, Tsuji H and Kimura T: Apotosis is a
novel therapeutic strategy for RA: Investigations using an experimental
arthritis animal model. Mechanical Loanding of Bones and Joints.
(Takahashi HE (Ed)). Springer-Verlag Tokyo,215-226, 1999
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corticotropin releasing factor (CRF)ファミリー神経ペプチドとその受容体の炎症性疾患における発現 |
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研究代表者 |
宇月 美和 |
所属 |
病理学第一講座 |
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共同研究者 |
笹野 公伸 |
所属 |
東北大学医学部 病理診断学講座 |
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村松 康成 |
所属 |
太田西ノ内病院 総合診療科 |
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高橋 和広 |
所属 |
東北大学大学院 医学系研究科 医学生物化学講座 分子生物学分野 |
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戸恒 和人 |
所属 |
東北大学医学部 腎・高血圧・内分泌科 |
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沖 隆 |
所属 |
浜松医科大学 内科学第二講座 |
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飯野 和美 |
所属 |
浜松医科大学 内科学第二講座 |
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澤井 高志 |
所属 |
病理学第一講座 |
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キーワード（日本語）
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神経内分泌 |
ウロコルチン |
CRF受容体 |
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関節リウマチ |
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Key Words (English)
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neuroencocrine |
urocortin |
CRF-Receptor |
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rheumatoid arthritis |
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【背景・目的】
Urocortin (UCN)は新しく発見されたcorticotropin
releasing factor (CRF)ファミリーの一つで, CRFとの相同性は45%であり, 機能的にも, CRFのレセプターであるCRF-Receptor (CRF-R) type1 とtype 2α, type 2βおよびCRF binding protein などに結合して, CRF作用の一部をもたらし, ACTH分泌促進作用はCRFと同等あるいはそれ以上とされている｡ ヒトにおいてはCRFをはじめとする神経ペプチドは中枢神経系の他に様々な細胞で産生されており, 関節リウマチ(RA)をはじめとする炎症性疾患1)や動物モデル2)においての関与も報告されている｡ 本研究ではRAにおけるUCNとCRF, およびそのreceptor であるCRF-Rの動態について検討した｡
【実験方法・材料】
対象はRA患者32例で, 同一関節の滑膜組織と関節液を用いた。 対照として変形性関節症 (OA) 7例，関節外傷例6例を用いた。 滑膜組織でUCNの分布(免疫組織化学)と産生(in situ hybridization,
RT-PCR)を検討し，同側の関節液で定量化(RIA法)を行った。 滑膜についてはCRFの免疫組織化学とCRF-R
1 と 2α, 2βのin
situ
hybridization, RT-PCRも行った。それぞれの滑膜組織については炎症の程度をスコア化し3，4)，UCN陽性細胞数や関節液中のUCN濃度と炎症との相関を検討した。また，滑膜組織中のUCN陽性となる細胞の同定は各種マーカーを用いた免疫組織化学にてミラー切片を作成して行った。
【結果】
滑膜組織では, 滑膜表層細胞やリンパ球, マクロファージ, 線維芽細胞など多彩な細胞でUCN陽性となり, RT-PCRでも全例に証明された｡ 滑膜でのUCN陽性細胞数と関節液中の濃度はともにRAで高値で, 対照例では低値であった｡ また, 滑膜組織でのUCN陽性細胞数と関節液中の濃度との間には有意な相関がみられ(R=0.7056, P＜0.001), 滑膜組織の炎症の程度と関節液中のUCN濃度にも正の相関(R=0.57)がみられた｡ また, CRFについてはUCNとほぼ同一の種類の細胞が陽性となり, 症例ごとの比較でもRAで陽性細胞数が多く, 滑膜組織の炎症スコアとCRF陽性細胞数との関係もよく相関しており, CRFとUCN陽性細胞は分布,量的にも同様な傾向を示した｡ さらに, CRF-R のRT-PCR のとin situ hybridizationを行ったところ, RA滑膜組織では主に-R1が高率に発現しており, 多彩な細胞で産生がみられUCN の分布と類似していた｡ 陽性細胞数もRAで多く, 他の対照例では少ないという傾向がみられた｡
R2αについてRT-PCR での陽性例は少数で, 一部のマクロファージで陽性となるが, R2βは全例陰性であった｡
また, R2αについて, RAでの陽性例は特に炎症の高度な症例であった5)｡
【考察と展望】
滑膜組織中のUCN陽性細胞と関節液中のUCN濃度とが相関していたことから，関節液中のUCNは関節滑膜局所で産生されている可能性がある。 UCNはCRFと分布が類似していたが, 滑膜組織内で多彩な細胞によって産生され, さらにレセプターであるCRF-Rもその周囲に陽性であることから, 局所でオートクライン, パラクライン的に作用する可能性が示唆された｡ CRFやUCNは全身に作用する場合は炎症に対して抑制的に働くことが知られているが, 実験的には炎症局所への投与によって, mast cell からの脱顆粒や血管透過性を亢進させ, むしろ炎症を増悪させるという報告もあり, 今回の結果を合わせると関節炎などの炎症局所においてもproinflammatory な作用をしている可能性が示唆された｡
≪研究業績≫
1) Hishinuma T, NakamuRA H, Sawai T, Uzuki M, Itabashi Y and Mizugaki M: Microdetermination of prostaglandin E2 in joint fluid in rheumatoid arthritis patients using gas-chromatogRAphy/selected ion monitoring. Prostag Oth Lipid M 58: 179-186, 1999
2) Matsuno H, Yudoh K, Uzuki M, Nakazawa F, Sawai T, Yamaguchi N, Olsen BR, KimuRA T: Treatment with Angiogenesis Inhibitor Endostatin Represents a Novel TheRApeutic Approach in Patients with Rheumatoid Arthritis. J Rheumatol 29: 890-895, 2002
3) Uzuki M, Watanabe T, KatsuRA Y and Sawai T: Quantitative histochemical study of hyalurinic acid binding protein and the activity of uridine diphosphoglucise dehydrogenase in the synovium of patients with rheumatoid arthritis. Anal Quant Cytol Histol 21:75-80, 1999
4) Yoshida W, Uzuki M, Kurose A, Yoshida M, Nishida J, ShimamuRA T and Sawai T: Cell chaRActerization of mononucleaRAnd giant cells constituting pigmented villonodular synovitis. Hum Pathol 34: 65-73, 2003
5) Uzuki M, Sasano H, MuRAmatsu Y, Totsune K, Oki Y, Takahashi K, Iino K, Sawai T : Urocortin in the Synovial Tissue of Patients with Rheumatoid Arthritis. Clinical Science 100: 577-589, 2001
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神経伝達物質アナンダマイドは好中球を活性化する |
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研究代表者 |
稲田 捷也 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
遠藤 重厚 |
所属 |
救急医学講座 |
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佐藤 成大 |
所属 |
細菌学講座 |
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キーワード（日本語）
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神経伝達物質 |
敗血症 |
炎症性サイトカイン |
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アナンダマイド |
好中球 |
ベロ毒素 |
Key Words (English)
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neurotransmitter |
sepsis |
proinflammatory cytokines |
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anandamide |
neutrophils |
VERO toxin |
【背景・目的】
感染，熱傷，手術などのストレスで，末梢単球・顆粒球の炎症性サイトカイン産生性は著しく低下する。一方で顆粒球(好中球)の活性化がおこりIL-8や顆粒球エラスターゼ産生は亢進し，侵襲性のストレスの終末像であるショックや多臓器不全等を招来する(参1, 2)（二次生体反応）。アナンダマイド(ANA)や2-アラキドノイルグリセロール（2-AG）は大麻の成分カンナビノイド（マリファナ）と相似の物質で，マリファナの生体内アゴニストとして発見された神経伝達物質で，多幸感，興奮，意識低下，記憶喪失，痛み変容などの作用をしめす。これらは脳で産生されほかマクロファージや血小板からも産生される。ANAの血中濃度は敗血症時に上昇し，血圧を降下させ，敗血症性ショックの初期メディエータとして考えられている。そこでANAや2-AGによる好中球活性化を接着分子発現やサイトカイン産生で検討した。
【実験方法・材料】
ヒト全血培養系にANAや2-AG （15-0.15mM），さらに対照としてLPS(0.1μg/ml)を加えて，4時間培養し，接着分子CD18，CD11bの発現や，細胞内サイトカイン産生，NF-kBの活性化をフローサイトメーターで検討した。顆粒球，単球，リンパ球はCD33染色性で区分した。CD33
(dim)を顆粒球，CD33
(bright)を単球，陰性をリンパ球とした。培養時にBrefeldin-Aを加えてサイトカインの細胞外への分泌を抑え，4時間培養し，CD33-FITCで染色してから小穴形成液処理し，抗サイトカイン-PEで細胞内サイトカインを染色した。CD33-FITCで染色後，CD11b-PEまたはCD18-PEで染色し，CD11bまたはCD18の蛍光量を検討した。
【結果】
ANAは顆粒球，単球でCD18発現を促進し，LPSによるCD18発現をさら亢進した。しかしLPSと異なりCD11bの発現は認められなかった。ANAはリンパ球画分でもCD18発現を促進した。顆粒球，単球ではANAはLPSとは異なり，顆粒球CD33発現を促進しなかった。細胞内TNF-α産生は単球と同様に顆粒球でも認められた。また，ANAは単球，顆粒球でNF-kBを活性化した。2-AGにはこれらの活性は認められなかった。
【考察と展望】
本研究でANAが好中球を活性化することを初めて明らかにした。ANAは多臓器不全などの敗血症の病態形成に関与していることが示唆された。しかし2-AGにそのような作用がないことは興味深い。最近ANAより2-AGが生体内でより重要との報告もあり今後さらに検討したい。
≪参考論文≫
(1)
稲田捷也, 遠藤重厚:エンドトキシン研究１基礎と臨床（日本エンドトキシン研究会編），菜根出版，97-103, 1998.
(2) Takakuwa T, Endo S, Shirakura Y,
Yokoyama M, Tamatani M, Tohyama M, Aozasa K, Inada K: Crit Care Med 28: 26859-2689,
2000
≪発表業績≫
1)
Inada K, Endo S, Sato S:
Activation of granulocytes by shiga-like toxins and its possible role in
pathogenesis of hemolytic uramic syndrome. 3rd Asia Pacific Conference on
Travel Health, July 2000, Denpasar, Indonesia
2)
稲田捷也，遠藤重厚，佐藤成大：敗血症性ショックの新規メディエータ，アナンダマイドによる好中球の活性化。日本細菌学会総会，2002年4月，横浜
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グリオーマ細胞および脳血管内皮細胞増生へのCTGFの影響 |
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研究代表者 |
黒瀬 顕 |
所属 |
病理学第一講座 |
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共同研究者 |
小林 哲人 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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澤井 高志 |
所属 |
病理学第一講座 |
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キーワード（日本語）
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CTGF |
神経膠腫 |
グリオーマ |
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脳血管内皮細胞 |
増生 |
脳腫瘍 |
Key Words (English)
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CTGF |
astrocytoma |
glioma |
|
endothelial cell |
growth |
brain tumor |
【背景・目的】
CTGF(connective tissue growth factor)は比較的新しい増殖因子で1991年にヒト臍帯静脈内皮細胞の培養上清より分離された。CTGFは主に線維芽細胞，血管内皮細胞等に発現することが報告されているが(参-1)，神経膠細胞あるいは神経膠芽腫細胞株にも発現することが確認されている(参-2)。神経膠細胞では，正常の細胞にも発現するが特に損傷後などの腫大した細胞に強く発現することが報告されている。CTGFは多彩な生理機能を有しているが(参-3)，その一つに血管内皮の増殖，接着，遊走に関与し血管新生を促すことが挙げられる。そこで悪性度と血管増生が比例する神経膠腫におけるCTGFの発現と，CTGFの脳腫瘍培養細胞および脳血管内皮培養細胞増殖への影響について調べた。
【実験方法・材料】
低悪性度astrocytomaと神経膠芽腫の手術検体を用い免疫組織染色でCTGFの発現を腫瘍細胞と血管内皮細胞それぞれにおいて検討した。また神経膠芽腫細胞株と脳血管内皮細胞を培養し，静止期，増殖期でCTGFの発現をフローサイトメトリーで調べた。またVEGF等，他の血管増殖因子の発現も検討した。脳血管内皮細胞の培養液中にCTGFを加えて増殖の変化を調べた。また脳血管内皮細胞の培養液中に抗CTGF抗体を加えて増殖の変化を調べた。
【結果】
神経膠芽腫では低悪性度のastrocytomaよりも腫瘍細胞および腫瘍内血管内皮細胞そｚれぞれのCTGF発現が亢進していた。脳血管内皮細胞は対数増殖期の方が静止期に比べてCTGFの発現が高かった。神経膠芽腫培養細胞では，VEGFやbFGFの発現の程度は腫瘍細胞株間でばらつきがあったものの，いずれの培養細胞株もCTGFの発現は高度であった。脳血管内皮細胞培養液にCTGFを加えたところ，10および50 ng/mlの濃度では増殖が亢進した。また脳血管内皮細胞培養液に抗CTGF抗体を加えたところ，10 ug/mlの濃度において増殖が抑制された。
【考察と展望】
脳腫瘍(特に膠芽腫)を含む悪性腫瘍において，血管新生の研究は日々進んでおり，多種のサイトカイン，増殖因子などの物質(VEGF, bFGF, angiopoetinなど)が腫瘍組織での血管新生に深く関与していることが判明しており，CTGFもその一つである。CTGFは主に線維芽細胞や血管内皮細胞に発現するが1)，神経膠細胞あるいは神経膠芽腫細胞にも発現するといわれている。CTGFの生理的機能は多彩であるが血管内皮細胞に対してはその増殖，接着，遊走を促進するといわれている。われわれの実験では低悪性度のastrocytomaよりも高悪性度のものの方が腫瘍細胞，血管内皮細胞ともにCTGFの発現が高かった。脳血管内皮細胞では増殖期にある細胞に高くCTGFが発現しているのが確認され，神経膠芽腫細胞株においても一様にCTGFの高い発現がみられた。また神経膠芽腫細胞株の増生に対するCTGFと抗CTGF抗体の影響の結果も加味すると，CTGFは腫瘍細胞の増生および高悪性度の神経膠腫の血管増生いずれをも促進していると考えられた。またparacrineによるCTGF発現に加え，内皮細胞自体のautocrineによる発現も存在していると考えられた。CTGFの血管内皮増殖作用がどの程度であるかは他の血管内皮増殖因子の作用と比較することによって示されると考えられ，今後の検討が必要であるが，CTGFを狙った神経膠腫の治療の可能性も示唆された。
≪参考論文≫
(1)
Babic AM, Chen CC, Lau LF. Mol.
Cell Biol 19: 2958-66, 1999
(2)
Xin LW, Martinerie C, Zumkeller W,
Westphal M, Perbal B: J Clin Pathol: Mol Pathol 49: M91-M97, 1996
(3) Kondo Y, et al.: Brain Research
834: 146-151, 1999
≪研究業績≫
1)
Pan L-H, Yamauchi K, Uzuki M, Nakanishi
T, Takigawa M, Inoue H, Sawai T: Type II alveolar epithelial cells and
interstitial fibroblasts express
connective tissue growth factor in idiopathic pulmpnary fibrosis. Europ Resp J, 17(6):1220-1227, 2001
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Neoplastic cells and proliferating endothelial
cells express connective tissue growth factor (CTGF) in glioblastoma |
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研究代表者 |
斉藤 立華 |
所属 |
病理学第一講座 |
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共同研究者 |
別府 高明 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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黒瀬 顕 |
所属 |
病理学第一講座 |
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山内 広平 |
所属 |
内科学第三講座 |
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菅原 淳 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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小川 彰 |
所属 |
脳神経外科学講座 |
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澤井 高志 |
所属 |
病理学第一講座 |
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キーワード（日本語）
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血管新生 |
脳腫瘍 |
膠芽腫 |
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血管増殖因子 |
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Key Words (English)
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CTGF |
angiogenesis |
glioblastoma |
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angiogenic factor |
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【背景・目的】
Connective tissue growth factor (CTGF)は1991年，ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の培養上清からはじめて発見された(参-1)。その後の研究でCTGFの発現はTGF-により誘導されるということが明らかとなり，CTGFがTGF-の線維化促進作用を直接担う結合組織増殖因子の一つであることが証明された。最近の培養細胞を用いた研究では，CTGFは血管内皮細胞の接着及び遊走を介して，血管新生を促進する新しい血管増殖因子であることが報告された(参-2)。しかし，ヒト腫瘍組織の血管新生におけるCTGFの役割に関する研究はまだ報告されていない。Glioblastomaは血管新生の豊富な腫瘍であることから，腫瘍組織からの何らかの血管新生因子の産生が示唆されるが，glioblastomaにおけるCTGFの役割を究明するため，手術材料を用いて，CTGFのmRNAとタンパク質レベルの発現を検討した。
【実験方法・材料】
本研究は13例のglioblastomaの患者の手術材料を用いて行った。手術により切除された腫瘍組織の一部をPLP固定液にて固定し，常法によりparaffin包埋を行い，連続切片を作製した。作製した連続切片に対してHE染色をおこない，初めに腫瘍組織の病理組織学的観察を行った。続いて，抗CTGF抗体, 抗GFAP抗体, 抗CD34抗体を用いて免疫染色を行い，CTGF蛋白の発現の程度，陽性細胞の分布などについて検討した1)。また，一部の症例では腫瘍組織からmRNAを抽出し，CTGFの合成primerを用いて，RT-PCRを行い，CTGFのmRNAレベルについて調べた。
【結果】
HE染色で観察した結果では，今回対象としたglioblastoma には，紡錘形細胞型，小 円形細胞型，巨細胞を呈する型など，多様な組織像が認められ，それぞれに細胞密度の高いものと低いものが認められた。そのいずれにも血管新生（奇形的小血管，内皮細胞の腫大，増殖）が目立った。
免疫染色の結果では腫瘍細胞が低分化（GFAP陰性）で細胞密度が高いものから，高分化（GFAP陽性）で細胞密度の低いものまで，腫瘍細胞の分化度に関わらず，glioblastomaの腫瘍組織では非腫瘍性の脳組織に比較し，CTGF蛋白の発現が高度に認められた。
増殖している血管は一部で腎糸球体様血管様になっているが，腫大した血管内皮細胞にCTGFの発現が証明された。なお，この血管様の組織はCD34あるいはFactor VIIIの免疫染色で確認している。
RT-PCRの結果では，今回扱った5例のGlioblastomaの症例においてCTGFのmRNAの発現が検出された。
【考察と展望】
本研究ではヒトglioblastomaの手術材料に対して抗CTGF抗体を用いて免疫染色を行った。その結果，CTGFは腫瘍組織において増殖している血管の内皮細胞や腫瘍細胞で強く染色され，これらの細胞でCTGF蛋白が発現していることが証明された。同様にRT-PCRにより腫瘍組織におけるCTGFのmRNAの発現も証明された。これまで報告されているCTGFのin vitro での血管新生作用を考慮すると，CTGFがglioblastoma においても血管新生に重要な役割をもつことが示唆される。特に血管増生の盛んな腫瘍組織として知られているglioblastomaで腫瘍細胞だけでなく，血管内皮細胞，マクロファージなどにも発現していることは，発現細胞の量からみても，血管新生と深いつながりをもっていることが示唆される。したがって，CTGFなどの血管増殖因子を阻止することにより腫瘍の治療に直接つながることが期待される(参-3)。
血管内皮培養細胞を用いたin vitroの研究ではCTGFに血管新生促進作用があることが示唆されているものの，腫瘍細胞内での発現，分布，血管新生との関係については未だ明らかにはされていない。CTGFと同じCCN遺伝子familyに属し，CTGFと高い相同性を持つCYR61も腫瘍血管新生を促進する作用を持つことが，腫瘍モデルで証明されている。さらに，Babicらの研究はCYR61の発現が腫瘍増殖過程で血管新生の’switch‘の役割を果たしていると推測されている。
今後，glioblastomaの組織型の違いによる定量的な解析と，培養系を用いたグリア細胞での発現の調節を検討する予定である。
≪参考論文≫
(1) Bradham DM, Igarashi A,
Potter RL, Grotendorst GR: J cell Biol 114:1285-1294, 1991
(2) Babic AM, Chen CC, Lau LF: Mol.
Cell Biol 19: 2958-66, 1999
(3) Folkman
J, Haudenschild C: Nature 288: 551-556, 1980
≪研究業績≫
1) Pan LH, Beppu T, Kurose A,
Yamauchi K, Sugawara A, Suzuki M, Ogawa A, Sawai T.: Neoplastic cells and
proliferating endothelial cells express connective tissue growth factor (CTGF)
in glioblastoma. Neurol Res 24:
677-683, 2002
2) PanL-H,
Yamauchi K, Uzuki M, Nakanishi T, Takigawa M, Inoue H, Sawai T: Type II alveolar
epithelial cells and interstitial fibroblasts express connective tissue growth
factor in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur Respir J 17 (6):1220-27, 2001
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腸管出血性大腸菌感染症における抗LPS抗体産生の動態に関する研究 |
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研究代表者 |
佐藤 成大 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
千田 勝一 |
所属 |
小児科学講座 |
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堤 玲子 |
所属 |
細菌学講座 |
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キーワード（日本語）
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腸管出血性大腸菌 |
抗LPS抗体 |
ELISA法 |
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ウエスタンブロット法 |
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Key
Words (English)
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enterohemorrahgic E.coli |
anti LPS antibody |
ELISA assay |
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Western blotting |
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【背景・目的】
腸管出血性大腸菌に分類される大腸菌は，赤痢菌に由来する遺伝子産物である志賀毒素（Stx）を産生し，出血性下痢，溶血性尿毒症症候群(HUS)，および脳症を発症する原因となる。この毒素遺伝子が挿入されている菌種は，その外膜成分であるリポポリサッカライド（ LPS ）に依存し，日本国内での発症は，O157， O111および O26血清型が大部分をしめている。幼児の重症例の感染菌種の同定や，患者免疫状態の把握が迅速に行われることが重要である。患者血清診断の標準化と散発症例の診断に適した検査方法の確立を目的とした。
【実験方法・材料】
方法は，大腸菌O157， O111，および O26型のLPSをターゲットとした，エライザ法（ELISA）とウエスタンブロット法で行った。
材料は，O157血清型大腸菌による集団食中毒の小学生24名，散発性の腸管出血性患者74名の急性期と回復期の血清を用いた。散発症例の原因菌は，糞便からの選択培地を用いたスクリーニングによって，O157， O111，および O26型検出症例が，それぞれ20，28，5症例，そして，21症例は，病原菌が同定できなかった。
【結果】
血清抗LPS抗体の測定には，竹田らの方法1）が提唱されているが，カットオフ値の設定，抗体価の表記法，交差反応の有無等に関する未解決部分が存在し，標準化が完全ではない。これらの点を解決する目的で，測定方法の検討を行った結果，陽性標準血清を使うことで，臨床応用が可能な測定系が確立できた。さらに，腸管障害病変にともなって，血清中に牛アルブミン（BSA）などのタンパク質に弱く結合する抗体が産生される症例が存在することを見いだした。この現象は，特に重要であり，従来法では測定不能検体とされた原因であることが明らかになり，解決策として，マイクロプレートのBSAによるブロッキング操作を省略することで，すべての検体について，評価可能な測定値がえられることを示した。
急性期血清で，抗LPS IgMおよびIgA抗体の上昇が顕著で，しかも糞便中からの分離菌の血清型と概ね一致した。逆に，糞便中からは病原菌が分離出来なかったが，血清中の抗O157LPS IgM 抗体が顕著に上昇した症例が存在した。感染症にともなう血清診断は，一般的にペア血清で行い，IgM抗体が低値から高値になることで評価されるが，出血性大腸菌感染症の場合には，出血性下痢等の発症による初診時にすでに抗体価が上昇していた。回復期血清として，1ヶ月，2ヶ月，1年を測定したところ，1ヶ月後には，低下した例が大部分であった。
散発症例として，一才以下の乳児の感染がまれではない。これらの乳児の血清抗体価の上昇はELISA法では極めて弱い特徴があった。60才以上の症例でも低い傾向があった。
本研究で特記すべきは，多くの症例において，細菌検査の手順にしたがって分離された一種の血清型の大腸菌LPSだけでなく，別の血清型LPSに対する抗体価も上昇していたことを明らかにしたことである。ウエスタンブロッティング法を用いて，各症例で検討した結果，血清の交差反応ではなく個人的に異なった抗体産生パターンが証明できた。
【考察と展望】
今回の実験は，患者とその家族の協力のもとで，生後3ヶ月から81才までの血清を検査対象とすることができた。抗体価評価の標準化ができたことによって，今後，散発症例の初診時の採血血清の評価が可能である。特に，IgM抗体の測定を，複数の大腸菌由来のLPSをコートしたスプリットタイプのマイクロプレートウエルを利用して行うことによって，患者への感染菌を推定できる可能性が高い。さらに，本研究で詳細に検討した結果， ELISA法に比較して，より個人的な免疫状態を反映することが明らかになったウエスタンブロッティング法の臨床検査への導入が望まれる。
従来，抗LPS抗体測定に関しては，分離菌のLPSに特異的に上昇する故に臨床診断に有用であるという立場の研究者が大半を占めてきた。しかしながら，本研究で明らかになったことは，多くの患者血清中の抗体価の上昇は，分離菌由来のLPSだけでなく付随的とも評価できる他の血清型LPSに対してもおこっていることである。このことは，感染源の大腸菌の由来がまちまちである散発例においては勿論のこと，集団発生の小学生の血清でも観察された。このような複数菌に対する抗体上昇に着目している研究グループはほとんどいないが，最近，オーストラリアのグループが，過去の症例について再検討した結果が報告された2）。かれらは，複数菌種にたいする免疫反応が上昇した症例の臨床的な症状は，免疫反応が単純な症例に比較して，重症である傾向があったといえる可能性を指摘している。複数菌に対する抗体上昇は，我々の実験からも，交差反応ではないことが，分かったので，今後の重要な研究テーマとなる筈である。
病原性のある複数菌種が原因食品に存在し，同時感染の形をとった結果であるのか，腸管障害に伴って，毒素遺伝子を持たない常在性細菌にたいする免疫反応が誘起されたのか，あるいは，過去の感染による記憶免疫細胞の活性化がおこる機構が存在するのかなどは，未だ不明である。本研究で示された検査法の利用によって，多数の症例検討がすすむことによって，患者の症状の重篤さと免疫反応の広汎さとの関係が明らかにされることが期待される。
≪参考論文≫
(1)
竹田多恵：日本細菌学会誌 52：796-799, 1997
(2)
Kulkanrni H, Goldwater PN, Martin
A, Bettelheim KA: Comp Immun
Microbiol Infect Dis 25: 249-268, 2002
≪研究業績≫
1) Ichinohe N, Tsutsumi R, Sasaki M, Shimooki O, Takahashi K, Inada K, Chida S, Sato S: Specific and nonspecific antibody responses to lipopolysaccharide (LPS) in enterohemorrhagic E. coli. Fourth International symposium and workshop on “Siga toxin-producing E. coli. Infection pp120. 2000, Kyoto.
2)
Tsutsumi R, Ichinohe N,
Shimooki O, Obata F, Takahashi K, Inada K, Sasaki M, Sato, S, Chida S:
Homologous and Heterologus antibody responses to lipopolysaccharide after
entero-hemorrhagic E. coli infection.
Microbiol Immunol (in press)
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腸管出血性大腸菌が産生するベロ毒素は脳に作用するか —ウサギモデルの検討— |
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研究代表者 |
高橋 清実 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
船田 信顕 |
所属 |
都立駒込病院 病理部 |
キーワード（日本語）
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ベロ毒素 |
Gb3 |
血管内皮細胞 |
|
虚血性病変 |
TNF-a |
PAI-1 |
Key Words (English)
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Shiga-like toxin |
Gb3 |
endothelial cells |
|
ischemic change |
TNF-a |
PAI-1 |
【背景・目的】
腸管出血性大腸菌感染症にしばしば合併する溶血性尿毒症症候群(HUS)では，ベロ毒素(Stx)による腎の毛細血管内皮細胞障害とそれに伴う多発性細小血管血栓症が主な病態であり， StxのレセプターGb3の腎における発現との関連が報告されている。一方Stxによる中枢神経系(CNS)障害の病態生理はいまだ明かではない。動物モデルでは，Stxが神経細胞を直接傷害する機序が考えられているが，Gb3のCNSにおける発現を示した報告はほとんどみられない。われわれはウサギCNS障害モデルを作製し，その病態と進展の機序に関して，Gb3の局在と神経組織障害および炎症性サイトカインの関与に着目して研究を行った。
【実験材料・方法】
1) Stx 2型
(Stx-2，デンカ生研から供与) は，蛋白濃度・ベロ細胞傷害活性を測定後 -70 ℃で保存。
2) 日本白色種ウサギ (オス，2.2〜2.5 kg) の左耳静脈から0.05〜5 mg/kgを投与し，臨床症状・致死量 (LD50)検討。
3) 深麻酔後生食次いで2%パラフォルムアルデヒド(PFA)で潅流固定しCNSを摘出後，4%PFAで一晩固定しパラフィン包埋標本を作製。
4) 免疫組織化学(参1)により，Gb3の局在と血管内皮細胞 (参2) の経時的変化を検討。
5) 炎症性サイトカイン—TNF-a，IL-1 bmRNA—と凝固線溶系に関与するPAI-1 mRNAの発現をRT-PCR法により経時的に検討。
【結果】
1) Stx-2の蛋白濃度は132 mg/ml，LPSの混入は1.642 ng/mlで，ウサギでの1 LD50は0.75 mg/kgであった1, 3)。 2) 0.1 mg/kg以上投与した全例で消化器症状が見られ，投与量に比例して増悪した。神経症状は1.0 mg/kg以上の投与でみられ，1.0 mg/kgでは約50％，2.0 mg/kg以上では83.3%に出現した。投与後28〜40時間で下肢麻痺(77.8%)あるいは上肢麻痺(11.1%)で発症し，次第に四肢麻痺次いで意識障害に進展増悪し死亡した1, 3)。3) 麻痺症例の脊髄灰白質には，細小血管の血栓形成と虚血性病変，それによる神経細胞の変性，血管壁の破綻や周囲へのフィブリンの析出，微小出血などが腰髄はじめ，どのレベルにおいても認められた。大脳・脳幹ではごく少数の微小出血および微少梗塞巣が散在性にみられる程度であった1, 3)。4) Stx-2投与により，反応性ミクログリアの増加（6時間以降），血管内皮の変性（12時間以降），血栓形成（24時間以降）が経時的に認められた1, 3)。 5) 麻痺発症時における腎機能・肝機能・血液凝固能は，Stx-2投与前と比べて変化はみられなかった1, 3)。6) Gb3は，脊髄灰白質と嗅球の大部分の血管において強く発現していたが，その他の細胞では検出されなかった。大脳・脳幹では非常に弱くごく少数の血管に限られていたが，Stx-2投与後発現が増強した2, 3)。7）CNS内におけるTNF-a mRNAは，Stx-2型投与後早期から発現が増強した。また，凝固線溶系の以上を示すPAI-1のmRNAも経時的に発現が増強した2)。
【考察と展望】
腸管出血性大腸菌が産生するStxによるウサギCNS障害モデルにおいて，最初に顕著に見られる神経所見は下肢麻痺であり，次第に四肢麻痺や意識障害などに進展増悪して死に至る。病理組織学的には1)，脊髄灰白質の細小血管のフィブリンや血小板などによる血栓形成と巣状の虚血性病変が主たる病変で，腰髄次いで頚髄の灰白質に強く現れ，胸髄においても散在性にみられた。病巣部の神経細胞は変性壊死し，周囲には二次的に腫大した軸索も散見された。これらの結果上下肢の麻痺が起こるものと考えられた。麻痺を発症した時点での大脳および脳幹の組織所見は，脊髄に比べて極めて軽微であった。
本研究でわれわれは，ウサギCNSにおけるStxのレセプター Gb3は脊髄灰白質のほとんど全ての細小血管に極めて強く発現しているが，大脳・脳幹（ただし嗅球を除く）での発現は非常に弱くごく少数の血管に限られていることを初めて明らかにした2, 3)。脊髄ではStxが灰白質の血管内皮に作用し細胞障害が惹起され，凝固線溶系の異常をきたし血栓形成が促進され，循環障害および巣状の虚血性病変に進展し，一方大脳・脳幹ではGb3の発現が少ないため，上述のような組織所見が軽微であったと思われる。以上よりStxによるウサギCNS障害および病理組織変化は，Gb3の局在と深く関連すると考えられた2, 3)。
Stx投与ウサギでは，全CNSにおいて早期から活性化ミクログリアが増加し，TNF-a mRNAの発現も増強した。また大脳・脳幹の細小血管におけるGb3の発現も，Stx投与後に増強することを明らかにした。これらのことから，Stxによる宿主側の二次的な反応がCNS障害の進展増悪に大きく関与すると推測される（執筆中）。
≪参考論文≫
(1)
Takahashi K, et al.: Ann Neurol
39:705-711, 1994
(2)
Esolen LM et al.: J Clin Invest
96:2478-2481, 1996
≪研究業績≫
1)
高橋清実，浅岡伸太，船田信顕，生田房弘，佐藤成大：ベロ毒素2型によるウサギ中枢神経障害の病理組織学的検討。第6回腸管出血性大腸菌感染症シンポジウム，2002年6月，東京
2)
高橋清実，小幡史子，船田信顕，佐藤成大：ウサギモデルにおけるベロ毒素2型による早期神経障害とGb3の局在について。第76回日本細菌学会総会，2003年4月，熊本
3)
Takahashi K, Funata A, Ikuta F,
Sato S: Localization of Gb3 in spinal cord of rabbit associates with early
neurological damage caused by shiga toxin 2. submitted
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マウス中枢神経系へのベロ毒素の作用 |
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研究代表者 |
小幡 史子 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
遠山 稿二郎 |
所属 |
解剖学第二講座 |
|
堤 玲子 |
所属 |
細菌学講座 |
|
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高橋 清実 |
所属 |
細菌学講座 |
|
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佐藤 成大 |
所属 |
細菌学講座 |
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キーワード（日本語）
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ベロ毒素2型 |
腸管出血性大腸菌 |
麻痺 |
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痙攣 |
MIP2 |
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Key
Words (English)
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VERO toxin 2 or Stx2 |
enterohemorrhagic Escherica coli |
paralysis |
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spasm |
macrophage inflammatory protein 2 |
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【背景・目的】
腸管出血性大腸菌O157:H7などが生産するベロ毒素は，これら細菌の感染症の病態形成に主要な役割を担うことが知られている。この感染症の主な症状は，下痢，血便，溶血性尿毒素症候群（HUS）に加え，重篤なものは神経症状を引き起こす。近年，国内外において，これら腸管出血性大腸菌感染症に関する研究が活発に行われているものの，神経症状発症のメカニズムはまだ明らかにされていない。そこで，我々は，ベロ毒素の2型(Stx2)を用いて，後肢麻痺などの神経症状を発症するマウスモデルを作成し，これの解析を行った。
【実験方法・材料】
stx2 遺伝子が挿入してあるpITY1プラスミドを内在させた大腸菌MC1061 / pITY1より，精製したStx2を実験に用いた。 マウスは，C57BL/6，雄，6〜10週齢を用いた。毒素投与後の運動率の減少の評価には，赤外線デジタルビデオカメラを用いた。Hematoxylin-eosin(HE)染色法を用いて，毒素投与後の脳，脊髄，腎臓を正常個体と比較した。この毒素の受容体であるGb3(CD77)を検出するために，蛍光抗体法を用いた。また，毒素投与後のサイトカイン，ケモカインのmRNA量変化をRT-PCR法により，評価した。
【結果】
この毒素をマウスに腹腔投与したところ，運動量の低下，著しい体重減少，後肢麻痺および痙攣を生じ，死に至った。LD50は，0.75ng/headであった。
HE染色では，脳，脊髄，腎臓ともに顕著な組織傷害を認めなかった。
CD77の局在を検出するとともに，それが発現している細胞種を特定する目的で，CD77をFITCで，神経系の細胞マーカーをTexas-Redで二重染色したところ，CD77は脊髄前角（灰白質）に局在したが，アストロサイト，ミエリン，ニューロフィラメント，マイクログリアのいずれのマーカーとも一致しなかった。また，マイクログリアは投与後の切片でも活性型の形態は示さなかった。
RT-PCRをreal-time thermal cyclerを用いて行った結果，投与群では運動量の低下が起こるより以前に，脊髄サンプルで，ケモカインmacrophage inflammatory protein-2 (MIP2)のmRNAが大幅に増加したが，TNF-αの増加量は少量にとどまり，他のサイトカイン(IL-1b，IL-6，IL-10)は投与前と変わらなかった。
【考察と展望】
Stx2の単独投与で，マウスに神経症状を発症するモデルを作成した。この動物モデルは，毒素50ng投与では，43〜45時間で神経症状発症，48時間以内に死に至ったが，10ng投与では神経症状発症および死亡時刻がそれより遅くなり，5ngでは，さらに遅い時刻に発症，死亡するという極めて毒素濃度依存的な反応が起こった。
しかしながら，HE染色では，後肢神経症状発症マウスの腰髄においても，神経細胞数の減少や，細胞浸潤，血管障害などの予想された傷害は検出されず，ルクソールファーストブルー染色など，他の染色法での検討が必要と考えられる。
毒素の受容体に関しては，CD77を脊髄で検出したものの，その細胞種を同定するに至っていない。今後，他の神経系細胞マーカーとの二重染色を行い，細胞種の同定を行いたい。
RT-PCRの結果から，ケモカインMIP2が病態になんらかの影響を与えている可能性が示唆された。他のケモカインについてはどうであるのか，MIP2がどのように影響しているのか等について今後検討していきたい。
我々の作成したStx2投与マウスモデルは，腎障害は発症せず，神経症状を発症する。このことは，この毒素の中枢神経系への毒性を解析する上で非常に有用である。今後も，このモデルを用いて，ベロ毒素と神経系の関わりについて解析を進めていきたい。
≪参考論文≫
1) 小幡史子, 遠山稿二郎, 高橋清実, 堤玲子, 佐藤成大：ベロ毒素2型による神経症状発症マウスモデルの解析。第7回腸管出血性大腸菌感染症シンポジウム, 2003年, 6月, 奈良
2) Obata F, Tohyama K, Takahashi K, Tsutsumi R and Sato S: Shiga-toxin 2 induces abnormal neurological sign in adult mice. VTEC 2003, June, 2003 Edinburgh, United Kingdom
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細菌性髄膜炎のカイコプラズマ(SLP)試験による迅速鑑別診断法 |
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研究代表者 |
稲田 捷也 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
高橋 清実 |
所属 |
細菌学講座 |
キーワード（日本語）
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カイコプラズマ試験 |
ペプチドグリカン |
グルカン |
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リムルステスト |
髄膜炎 |
診断 |
Key Words (English)
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SLP test |
peptidoglycan |
glucan |
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Limulus test |
meningitidis |
diagnosis |
【背景・目的】
カイコ(Bombyx mori)幼虫の血漿（silk worm larva plasma: SLP）の黒変化現象（メラニン形成）は，ペプチドグリカン（PG，グラム陽性，陰性菌の細胞壁成分）やβ(1,3)-D-グルカン（BG，真菌の細胞壁成分）によっておこるフェノールオキシダーゼ反応であり，その反応カスケードがほぼ解明された（参1）。最近これを応用してPGやBGを定量法するSLPテストが開発された（和光純薬工業）（参2）。この研究ではSLPテストとリムルステストを組み合わせて細菌性髄膜炎の迅速鑑別診断法を考案した（参3）。
【実験方法・材料】
市販の2つのリムルステスト（エンドトキシンとグルカンに反応するHS-テストワコー（通常法）とエンドトキシンに特異的なES-テストワコー（エンドトキシン特異法）；いずれも和光純薬工業）と，SLPテストを用いた。それぞれの測定原理はゲル化転倒法とトキシノメーターを用いたカイネティック比濁時間分析法である。髄液中の阻害因子の影響を除外するため水希釈法を検討し，水で8〜16倍に希釈すると阻害因子の影響を無視できることが判ったので水で8倍に希釈して用いた。2時間以内に結果を得た。対象症例:グラム陰性菌の検出された3例とその疑いの1例，グラム陽性菌が検出された2例，真菌性髄膜炎疑いの1例。この他エコーウイルス30（E30）分離された無菌性髄膜炎症例6例，E30抗体価の上昇した3例，咽頭拭い液からE30が分離された3例の計12例，非感染性神経性疾患などの患者11例（てんかん9例, ギランバレー症候群1例， 運動失調症1例）。
【結果】
グラム陰性菌髄膜炎では2つのリムルステストが陽性でSLPテストで高値を示した。グラム陽性菌髄膜炎ではSLPテストのみが高値であった。真菌性髄膜炎を疑った症例（血中よりC. albicans検出）ではHS-テストワコー陽性，SLPテスト高値であった。無菌性髄膜炎や非感染性神経性疾患患者などではリムルステスト陰性で，SLPテストは検出限界以下であった。
【考察と展望】
細菌性髄膜炎は予後不良の疾患で，早期診断が重要である。これまでリムルステストによって患者髄液中のエンドトキシンを定量して，グラム陰性菌による髄膜炎を診断する方法が用いられてきた（参4）。SLPテストは血漿前処理法が開発されておらず，血漿にはいまだ適応されないが，我々は初めて生体材料に応用した。その結果，2つのリムルステストとSLPテストを組み合わせると，菌種は特定できないが，グラム陰性菌，陽性菌，真菌性，ウイルス性髄膜炎の簡便かつ迅速な鑑別診断法として，応用可能であることを明らかにした。即ちグラム陰性菌髄膜炎では2つのリムルステストとSLPテストがいずれも陽性，グラム陽性菌髄膜炎ではSLPテストのみ陽性，真菌性髄膜炎ではリムルステスト通常法とSLPテストが陽性，ウイルス性（無菌性）髄膜炎ではいずれも陰性である。
このテストは肉眼で黒変化を判断できるので，高価なトキシノメータを用いることなく定性法としても使用可能である。
≪参考論文≫
(1)
Ashida M, Yamazaki H I: Biochemistry
of the phenoloxidase system in insects with special reference to its
activation, p.239-265. In Onishi E,
Ishizaki H (eds), Molting and metamorphosis, Japan Sci Soc Press, Tokyo. 1990
(2)
Tsuchiya M, Asahi N, Suzuoka F,
Ashida M, Matsuura S: FEMS Immunol Med Microbiol 15: 129-134. 1996
(3)
Inada
K: Rapid and differential diagnosis of gram-positive, gram-negative and fungal
meningitis by limulus amebocyte lysate and silkworm larvae plasma assays. Symposium on Meningitis of Children. August
1995. Jakarta, Indonesia.
(4)
一戸貞人，稲田捷也，根本照子，村田淳，一戸奈穂子，藤原哲郎，吉田昌男：感染症誌
69: 1227-1234, 1995
≪研究業績≫
1)
Inada K, Takahashi K, Ichinohe
S, Suda H, Tsuchiya M, Takahashi , Matsuura S, Kasai
T, Yoshida M, Endo S, Sato S: A silkworm larvae plasma test
for detecting of peptidoglycan in cerebrospinal fluid is useful for the
diagnosis of bacterial meningitis. Microbiol
Immunol, 47: 701-707, 2003
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生体分子CAP18ペプチドの，微生物感染に対する役割とその臨床応用 |
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研究代表者 |
平田 陸正 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
磯貝 恵美子 |
所属 |
北海道医療大学 歯学部 口腔衛生学講座 |
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小熊 恵二 |
所属 |
岡山大学 医学部 細菌学講座 |
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長岡 功 |
所属 |
順天堂大学 医学部 生化学第二講座 |
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キーワード（日本語）
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CAP18 |
抗菌ペプチド |
自然免疫 |
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LPS中和活性 |
獲得免疫 |
ケモカイン |
Key Words (English)
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cationic antibacterial protein of 18kd |
antibacterial peptide |
innate immunity |
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lipopolysaccharide neutralizing activity |
aquired immunity |
chemokine |
【背景・目的】
Cationic Antibacterial Protein 18kd
(CAP18)は，我々がウサギの顆粒球より分離した抗エンドトキシン，殺菌活性を示すアミノ酸142残基からなるペプチドである(参1)。これまで，C末端が抗菌性ペプチドとして働くこと，数種の合成ペプチドを用いてLPS中和活性の比較したところ，34残基ペプチドが最も強い活性を示すことを明らかにした。さらに活性の高いペプチドを得るため，ペプチド残基の修飾を行い，ペプチドのN末端をアセチル化し，C末端をアミド化すると，ペプチドの安定性が増すことがわかった。また，ペプチド内部のアミノ酸をいくつか置換し，a-へリックス構造をとるこのペプチドの片側の疎水性領域を増すと，活性が増加することもわかった。CAP18の抗菌スペクトルはグラム陰性菌とグラム陽性菌をともに網羅している。ヒト相同体もcDNAクローニングされアミノ酸142残基からなるペプチドhCAP18である (参2)。今後CAP18あるいはその活性単位の，抗菌剤としての臨床応用が期待されるが，特に細菌性髄膜炎や脳症をともなう重症感染症の治療または予防に応用されることが望まれる。本研究では，CAP18の実験的腸管出血性大腸菌O157:H7感染症の治療効果や本来の作用以外の新しい活性について検討した。
【実験方法・材料】
腸管出血性大菌感染モデルでの治療効果(参考3）：無菌マウスにE. colli O157を経口感染させ，約16時間後に下痢などの症状が現れ，最終的には全マウスが四肢麻痺あるいは痙攣を起こして死亡する系で，感染の16時間後から27残基のアミノ酸置換体を20mg腹腔内に投与し治療効果を検討した。抗生物質レボフロキサシン（LVFX）との併用効果も検討した。また，ヒト赤血球由来のGb3をリポゾームに取り込ませ，感染1日目と2日目に静脈内に投与て治療効果を検討した。
デフェンシンとの相乗効果1）：デフェンシンも顆粒球由来の抗菌蛋白であるが，CAP18との大腸菌やブドウ球菌に対する相乗効果を検討した。
マスト細胞からのプロスタグランジンＤ2およびヒスタミン産生2）：Sprague-Dawleyラットの腹腔細胞を38%BSAの密度勾配法で得たマスト細胞にヒト37残基ペプチドを加えて，ヒスタミンを蛍光法で測定した。プロスタグランジンＤ2はRIAで測定した。
【結果】
腸管出血性大腸菌感染モデルでの治療効果(参考3）：非置換体ではなく全く効果がなかったが，LL置換体（2カ所ロイシンで置換した27残基ペプチド；27LL）投与群では40％のマウスが生残し，FF置換体（2カ所フェニルアラニンで置換した27残基ペプチド；27FF）では60％のマウスが生残した。なおIn vitroでのE. coliO157に対する抗菌活性をIC50で比較すると非置換体は＞10mg/mlであったのに対して，27LLが0.8mg/ml，27FFが0.7mg/mlであった。また，エンドトキシンショックに対する防御効果は27FFが最も高かった。抗生物質レボフロキサシン（LVFX）とペプチドを併用した場合はさらに生存率が高まった。Gb3単独投与群では発症の遅延がみられたものの最終的にはすべてのマウスが死亡したが，Gb3と抗生剤併用群では80％のマウスが生残した。Gb3，抗生剤および27FFの3剤を併用した群ではすべてのマウスが生残した。
デフェンシンとの相乗効果1）：ディフェンシンは好中球外の生理食塩濃度では大腸菌やブドウ球菌などに対する抗菌活性を失うのに対し，CAP18は好中球外でも活性を保つが，CAP18の生理食塩中での抗菌活性は，ディフェンシンをともに存在させることにより増強することがわかった。また，大腸菌の膜透過性を増強する活性についても同様のことが観察された。
ヒト37残基ペプチド処理マスト細胞はヒスタミンを産生し，細胞内カルシウムの可動化が量依存性に認められた。この活性はBAPTA-AM（細胞内カルシウムのキレート剤），百日咳毒素，U-73122（フォスフォリパーゼＣ阻害剤）で抑制された2）。
【考察と展望】
CAP18ペプチドの置換体はE. coliO157感染モデルに対して防御能を示すこと，また，抗生剤やベロ毒素受容体との併用でより防御効果が高まることが示された。
CAP18の抗菌活性にデフェンシンと相乗効果が認められたことは重要で，生体内でのCAP18の効果をより確実にすると考えられる。
CAP18がラットマスト細胞からのヒスタミン遊離を促進したが，この活性は阻害実験の結果から，Ｇ蛋白-フォスフォリパーゼＣ依存性に起こっていることが示唆された。このことにより，CAP18が自然免疫だけでなく，炎症反応にも関与することが示された。これはCAP18の新しい活性として注目される。
感染症治療など臨床応用を目的とした場合，抗原性，毒性などの点で生体内由来物質であるヒトCAP18を用いた方が抗生物質などより生理的であり，理想的である。また，生産コストの面からは，より短いペプチドであるほうが望ましい。それには，安全性と高い抗菌活性を持つペプチドが有用である。より活性の高いアミノ酸置換体の検索や，安全性の検証を進め臨床応用に近づけていきたい。
また，前述したように，CAP18ペプチドの新しい活性としてケモカイン様活性が最近報告された。CAP18ペプチドが免疫担当細胞に対して走化性を示すことはこのペプチドが自然免疫だけでなく，微生物感染に対して獲得免疫を誘導することも示唆している。今後はこのケモカイン様活性についても注目し，検討していきたい。
≪参考論文≫
(1) Larrick JW, et al.: Biochem Biophys Res Commun 179: 170-173, 1991
(2) 平田陸正: 蛋白質
核酸 酵素 46: 575-81,
2001
(3)
磯貝恵美子, 平田陸正, 磯貝浩, 渡来仁, 横田憲治, 小熊恵二：第47回毒素シンポジウム, 2000年7月, 倉敷
≪発表業績≫
1) Nagaoka I, Hirota S, Yomogida S, Ohwada A, Hirata M: Synergistic actions of antibacterial neutrophil defensins and cathelicidins. Inflamm Res 49: 73-79, 2000
2) Niyonsaba F, Someya A, Hirata M, Ogawa H, Nagaoka I: Evaluation of the effects of peptide antibiotics human α-defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and prostaglandin D2 production from mast cells. Eur J Immunol 31: 1066-75, 2001
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AIDSでみられる空胞性脊髄症に関する病理組織学的研究とHIVの分子疫学 |
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研究代表者 |
佐藤 成大 |
所属 |
細菌学講座 |
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共同研究者 |
高橋 清実 |
所属 |
細菌学講座 |
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Dmitri
Nossik |
所属 |
D.
I. Ivanovsky Institute of Virology , Moscow |
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長縄 聡 |
所属 |
国立感染症研究所 エイズ研究センター |
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船田 信顕 |
所属 |
都立駒込病院 病理部 |
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キーワード（日本語）
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エイズ |
ヒト免疫不全ウイルス |
分子疫学 |
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空胞性脊髄症 |
浸潤マクロファージ |
TNF-a |
Key Words (English)
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AIDS |
HIV |
molecular epidemiology |
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vacuolar myelopathy |
infiltrated macrophages |
TNF-a |
【背景・目的】
1）空胞性脊髄症(VM)は，HIV脳症とならんで頻度の高い神経障害であるが，その病態は未だ明らかではない。今回AIDS症例の脊髄組織におけるVM発症とMfの局在およびTNF-a mRNA（参2）発現と病態との関連について検討した。
2）近年ロシアにおけるHIVの流行が顕在化し(CDC-Emerging Infectious Diseases in Russia, 1990-1999)，東南アジアにも飛び火している。流行の中心であるサブタイプBの分子疫学的研究を行った。この研究は予防ワクチンや治療用ワクチンの開発につながる。
【実験方法・材料】
1）AIDS 35例（D.I. Ivanovsky Institute of Virologyの17例，Johns Hopkins Universityの14例，都立駒込病院の4例）の脊髄75切片，HIV感染のない5例の脊髄7切片を用いた。病理組織学的所見（H&E染色とLFB染色）， MfおよびHIV感染細胞の局在（免疫組織化学法）， TNF-a mRNAの発現（in situ RT-PCR法）について検討した。
2）Ukraine地方の麻薬静注によるHIV感染者8例の血液(’97～’98)を用い，血漿からウイルスRNAを抽出した。nested RT-PCR法によりHIV-1 gagおよびenv領域を増幅後塩基配列を決定し，それぞれのアミノ酸塩基配列をもとに解析した。
【結果】
1）35例中15例でVMと診断された。空胞化変性はおもに中〜下部胸髄の後索と側索にみられ，病巣部に一致して空胞の内外に多数のMfの浸潤がみられた。HIV-1のproductive infection（増殖性感染）を示すp24抗原は3例で陽性であった。VMのなかった20例中8例(40%)で，好発部位である後索〜側索に，VM症例と同様の多数の浸潤Mf がみられ，p24抗原は1例で検出された。HIV感染のないものではMf ，p24抗原ともに検出されなかった。TNF-a mRNAは多くの浸潤Mfに発現していた1)。
2）これまで我々のグループが得たロシアおよびウクライナのHIV-1/subtype
B(’85～’95)についてV3領域の塩基配列をもとに解析した結果，subtype A，B，A/B の流行が顕著であり，なかでもsubtype Bの流行は今後とも拡大することが予想された。ロシアで流行しているsubtype Bに関して遺伝子を元に細かくtype分け(A～G:系統樹)し，本研究で解析した塩基配列とロスアラモス研究所データバンクに登録されているHIV-1/env/V3を比較検討した。
登録があった国は，ロシア周辺国でチェコ，エストニア，フィンランド，ギリシア，ハンガリー，イラン，リトアニア，ノルエー，リトアニア，スロバキア，ウクライナの11ヶ国で，遺伝的に大きく外れるE，G以外は周辺国でも見られる事が判明した。この事はロシア及び周辺国に同じHIV-1/subtype Bが流行している事を示している。
【考察と展望】
1）これまでにVMの病因として，脊髄におけるHIV感染の関与またはHIV感染以外の要因—ビタミンB12や葉酸の欠乏，日和見感染，炎症性サイトカインなど—の関与が報告されている。
今回のわれわれの結果より，VM病巣とHIV productive infectionとの関連は低かった。しかし，VM 15例の全例とVMのなかった20例中8例 において後索〜側索へ浸潤したMf が検出されたことから，Mf は単なるscavengerとして働くだけではなく，病巣形成前から脊髄に浸潤し病巣形成に重要な役割を演じていると考えた。これらのMf の多くはTNF-α
mRNAを発現しており，炎症性サイトカインによるoligodendrogliaなどに対する組織障害の可能性が示唆された。今後は，浸潤Mfにおけるproviral DNAの検出により，non-productive infectionとVM発症との関連についてさらに検討したい。
2）今回ロシアとその周辺諸国においてHIVのsubtype Bが広く流行していることが確認された2)。今後極東および本邦で新たに分離されるsubtype Bを比較検討し，わが国および周辺地域におけるロシア型subtype Bの侵淫状況を追跡していく。また我々が調べたものを含め，subtype Bの主要中和領域のアミノ酸配列は安定しており，今後のsubtype Bの流行拡大においても保持される可能性が高い。我々はペプチドELISAを利用し，血清学的にsubtype Bを診断する系を確立しつつある。この方法は同時に中和抗体の検出にも役立ち，予防ワクチン開発のための基礎研究となりうる。従って今後はこれらの研究から得られるデータをもとに，すでに開発されているHIVリコンビナントBCGワクチン技術を応用し，subtype Bの予防および治療ワクチンを開発していく予定である。
≪参考論文≫
(1)
Takahashi K, et al.: Ann Neurol 39:705-711,
1994
(2)
Wesselingh SL et al.: J Neuroimmunol
74:1-8, 1997
≪研究業績≫
1)
高橋清実 ，Dmitri Nossik，船田信顕，佐藤成大：AIDSでみられる空胞性脊髄症におけるマクロファージの役割。第７回日本神経感染症学術集会，2002年10月，東京
2)
Naganawa S, Sato S, Nossik D,
Takahashi K, Hara T, Tochikubo O, Kitamura K, Mitsuo H: First report of CRF03＿AB recombinant HIV Type 1 in injecting drug users in Ukraine. AIDS Res Hum Retrov 18:1145-1149, 2002
3) 長縄 聡，泉 泰之，高橋清実 ，佐藤成大，藤崎茂巳，藤崎恭大，三谷満昭，網 康至，中村正彦，本多三男，仲宗根 正，栃久保 修，北村勝彦：メタロエンドペプチダーゼ-FのHIVに及ぼす影響。日本エイズ学誌5：1-7，2003
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向神経性ウイルスの感染機序と神経回路解析法の開発 |
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研究代表者 |
遠山 稿二郎 |
所属 |
解剖学第二講座 |
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共同研究者 |
平野 紀夫 |
所属 |
岩手大 獣医微生物学 |
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大岡 静衣 |
所属 |
東京大 大学院 医学研究科 微生物学 |
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端川 勉 |
所属 |
理研 神経科学総合研究センター 神経構築 |
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キーワード（日本語）
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コロナウイルス |
ポリオウイルス |
向神経性 |
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グリア細胞 |
実験動物 |
経シナプストレーサー |
Key
Words (English)
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coronavirus |
poliovirus |
neurotropism |
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glial cells |
experimental animals |
trans-synaptic tracer |
【背景・目的】
シナプスを越えて運搬されるなトレーサーがあれば，一連の伝導路を一挙に解析できる。これまで狂犬病ウイルス，偽狂犬病ウイルス（ヘルペスウイルス）等を使う試みがあったがいずれも，病原性が高いため，その使用は難しく，成功する確率は低かった。平野らは，ブタ由来のコロナウイルス（HEV）が，四肢など末梢から接種されると，血管経由ではなく，神経系経由で中枢の神経細胞が感染することを見出した。また，大岡らは，ポリオウイルスのリセプター（PVR）の遺伝子を導入した動物および培養細胞を作成することに成功している。これらのウイルスと系を使用し，感染メカニズム，および経シナプストレーサーとしての可能性を検討した。
【実験方法・材料】
マウス，ラット，ハムスター，スナネズミ，モルモットを用いた。四肢，体幹などの皮下，あるいは骨格筋内にHEVを接種した。ラットでは，視覚伝導路，嗅覚伝導路などへの応用も試みた。接種後，1日から4週間の期間で，ウイルス学的検索用には，動物を屠殺後直ちに中枢神経組織を部位別に採取し，培養細胞系を用いたウイルスの分離・確認を行った。組織学的検索用には，還流固定を実施し，中枢神経組織を摘出，抗HEV抗体を用いた免疫組織化学を実施した。また，ポリオウイルスレセプター（PVR）を導入した培養細胞を使用し，ポリオウイスルの感染成立様式を解析した。
【結果】
これまでに実施した，マウス5)，ラット1,2,3)，ハムスター，スナネズミ，モルモットで，末梢組織接種後，中枢神経系組織よりHEVが分離された。感染が成立した場合，いずれの動物種でも神経症状を示した。発症機序は現時点では不明であるが経神経性伝播が強く示唆された。ラットでは，硝子体内にHEVを接種した場合，視覚の伝導路に沿って（上丘，外側膝状体核，大脳皮質視覚野）ウイルスが確認された3)。鼻粘膜へHEVを滴下した実験例では，接種後短期間のものでも，嗅球，海馬，脳幹の一部の神経核の大型細胞がHEV陽性を示した2)。これまでの実験では，必ずしも，順を追って感染が広がっていく過程を把握できなかったが，嗅覚伝導路と矛盾する経路ではないと考えられるので，接種量，屠殺までの期間を工夫することで，伝導路を把握できる可能性があると考えている。また，これまで，神経科学領域で応用されてきた神経親和性ウイルスの代表である偽狂犬病ウイルス（ヘルペスウイルス）は，濃厚感染部位ではニューロンのみならずグリア系細胞も感染している。これに対し，HEVの感染組織では，グリア系細胞に感染する明かな所見が得られていない。
極性を持った培養細胞にPVRを強制発現させ，ポリオウイルスの感染メカニズムを調べたところ，PVRが細胞の物質の取りこみに関与するクラスリン関連分子と関連して，apical membrane とbasolateral membraneでは明らかな発現性の相違が認められた4)。
【考察と展望】
これまで私達の研究により，HEVが，主な実験動物である，マウス，ラット，ハムスター，モルモット，スナネズミにおいて，向神経性ウイルスであることが明かとなっている。 また，投与後の病態は，動物種による差が多少見られるものの，同程度のPFUの偽狂犬病ウイルスを投与した場合と比較すると，極めて軽微であり，伝導路解析に必要な期間を比較的健康に維持することが容易であると考えられる。 また，感染した神経細胞も，激烈な病変を示す事無く，比較的健康な状態を保っていると考えられる。 これらの事実は，HEVが，シナプスを越えて伝搬するトレーサーとして，優れた特性を備えていることを示したものである。 しかし，現時点では，トレーサーとして使用する場合の適正な濃度（PFU），投与後の経過期間など，未だに精査なデータが不足している。 今後はさらに基礎的データを集積すると共に，本ウイルスの中枢神経経における感染様式の解明も含め，研究を継続する予定である。同時に，スライス標本への局所（細胞内）接種を行い，ウイルス伝搬の詳細な検索も実施したい。 また，PVRを遺伝子導入することによって得られた培養細胞は，神経親和性ウイルスの感染メカニズム解明のツールとして極めて有用であるので，今後，さらに共同研究を発展させ，形態学的により詳細な検索を実施したいと考えている。
今後，サブナノメータでの分子局在をも念頭に入れた電子顕微鏡による解析を進めたい。そのため，急速凍結法・電顕トモグラフィー法，とCryo-EMを駆使することで実用可能な未知の領域の極超微細形態の解析法を開発したい。
≪研究業績≫
1)
Hirano N, Haga S, Yada Y,
Tohyama K: Susceptibility of rats of different ages to inoculation with swine
haemagglutinating encephalomyelitis virus (a Coronavirus) by various routes. J
Comp Pathol 125: 8-14, 2001
2)
Hirano N, Tohyama K, Taira H,
Hashikawa T: Spread of hemagglutinating encephalomyelitis virus in the CNS of
rats by intranasal route. Adv Exp Med Biol 494:127-132, 2001
3)
Hirano N, Tohyama K, Taira H, Hashikawa
T: Infection of hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) at tHEVisual
pathways of rats. Adv Exp Med Bio. 494:149-154,
2001
4)
Ohka S, Ohno H, Tohyama K,
Nomoto A: Basolateral sorting of human poliovirus receptor a involves an interaction with the m1B
subunit of the clathrin adaptor complex in polarized epithelial cells. BBRC
287:941-948, 2001
5)
Hirano N, Nomura R, Tawara T,
Tohyama K: Neurotropism of swine haemagglutinating encephalomyelitis virus
(Coronavirus) in mice depending upon host age and route of infection. J Comp Pathol (in press)